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1、临床微生物学检验一、纸片扩散法又称 Kirby-Bauer(K-B)法，由于其在抗菌药物的选择上具有灵活性，且花费低廉，被 WHO推荐为定性药敏试验的基本方法，已在临床广泛使用。（一） 实验原理将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼脂平板上，纸片中所含的药物吸收琼脂中的水分溶解后不断向纸片周围扩散形成递减的梯度浓度，在纸片周围抑菌浓度范围内测试菌的生长被抑制，从而形成无菌生长的透明圈即为抑菌圈。抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度，并与该药对测试菌的 MIC 呈负相关。（二） 培养基和抗菌药物纸片1、 抗菌药物纸片 选择直径为 6.35mm，吸水量为 20l 的专用药敏纸片，用逐片
2、加样或侵泡方法使每片含药量达规定所示。含药纸片密封贮存 28或-20无霜冷冻箱内保存，-内酰胺类药敏纸片应冷冻贮存，且不超过一周。使用前将贮存容器移至室温平衡 12 小时，避免开启贮存容器时产生冷凝水。2、 培养基 水解酪蛋白（ Mueller-Hinton,M-H）培养基是 CLSI 采用的兼性厌氧菌和需氧菌药敏试验标准培养基，pH 为 7.27.4，对那些营养要求高的细菌如流感嗜血杆菌、淋病奈瑟菌、链球菌等需加入补充物质。琼脂厚度为 4mm。配置琼脂平板当天使用或置塑料密封袋中 4保存，使用前应将平板置 35温箱孵育 15 分钟，使其表面干燥。（三） 实验方法实验菌株和标准菌株接种采用直接
3、菌落法或细菌液体生长法、用 0.5 麦氏比浊管标准的菌液浓度，校正浓度后的菌液应在 15 分钟内接种完毕。操作步骤如下：1、 接种 用无菌棉拭子蘸取菌液，在管内壁将多余菌液旋转挤去后，在琼脂表面均匀涂抹接种 3 次，每次旋转平板 60 度，最后沿平板內缘涂抹一周。2、 贴抗菌药物纸片 平板置室温下干燥 35 分钟，用纸片分配器或无菌镊子将含药纸片紧贴于琼脂表面，各纸片中心相距24mm，纸片距平板內缘 15mm ，纸片贴上后不可再移动，因为抗菌药物会自动扩散到培养基内。3、 孵育 置 35孵育箱 1618 小时后阅读结果，对苯唑西林和万古霉素敏感等应孵育 24小时。（四） 结果判断和报告用游标卡
4、尺或直尺量取抑菌圈直径（抑菌圈的边缘应是无明显细菌生长的区域） ，先量取质控菌株的抑菌环直径，以判断质控是否合格；然后量取试验菌株的抑菌环直径。根据CLSI 标准，对量取的抑菌圈直径作出“敏感” 、 “耐药” 、 “中介”的判断。（五） 质量控制对于肠杆菌科细菌，M-H 琼脂，生长法或直接菌落悬液法，相当于 0.5 麦氏标准的细菌浓度，35+-2，空气，1618 小时观察结果，质控菌株推荐为大肠埃希菌 ATCC25922，大肠埃希菌 ATCC35218（为监控 -内酰胺酶/-内酰胺抑制剂纸片用） ；对于铜绿假单胞菌 ATCC35218；对于葡萄球菌属细菌， 1618 小时观察结果，测苯唑西林、
5、甲氧西林、萘夫西林和万古霉素需 24 小时，试验温度超过 35不能检测甲氧西林耐药葡萄球菌，推荐质控菌株为金黄色葡萄球菌 ATCC25923，大肠埃希菌 ATCC35218，纸片扩散法检测葡萄球菌对万古霉素的敏感性不可靠；对于肠球菌属细菌，1618 小时观察结果，测万古霉素需 24 小时，推荐质控菌株为粪肠球菌 ATCC29212;对于流感嗜血杆菌和副流感嗜血杆菌，推荐质控菌株为流感嗜血杆菌 ATCC49247，流感嗜血杆菌 ATCC49766，大肠埃希菌ATCC35218（测试阿莫西林/克拉维酸时） ；对于肺炎链球菌和肺炎链球菌之外其他链球菌，培养基为 M-H 琼脂+5%羊血，35+-2，5
6、%CO2,2024 小时观察结果，推荐质控菌株为肺炎链球菌 ATCC49619.二、稀释法（一） 肉汤稀释法1、 培养基 使用 M-H 肉汤，需氧菌、兼性厌氧菌在此培养基中生长良好。在该培养液中加入补充成分可支持流感嗜血杆菌、链球菌生长。培养基制备完毕后应校正 pH 为7.27.4（25） 。离子校正的 M-H 肉汤（cation-adjusted Mueller-Hinton broth，CAMHB ）为目前推荐的药敏试验培养基。2、 药物稀释 药物原液的制备和稀释遵照 CLSI 的指南进行。3、 菌种接种 配制 0.5 麦氏浓度菌液，用肉汤（宏量稀释法） 、蒸馏水或生理盐水（微量稀释法）稀
7、释菌液，使最终菌液浓度（每管或每孔）为 5x105CFU/ml，稀释菌液于 15分钟内接种完毕，35孵育 1620 小时，当试验菌为嗜血杆菌属、链球菌属孵育时间为 2024 小时，葡萄球菌和肠球菌对苯唑西林和万古霉素的药敏试验应孵育时间为24 小时。4、 结果判断 以在试管内或小孔内完全抑制细菌生长的最低药物浓度为最低抑菌浓度（minimal inhibitory concentration，MIC）(g/ml)。微量稀释法时，常借助于比浊计判别是否细菌生长。有时根据需要测定最低杀菌浓度（minimal bactericidal concentration,MBC）;把无菌生长的试管（微孔）吸
8、取 0.1ml 加到冷却至 50M-H 琼脂混合倾注平板，同时以前述的稀释 1:1000（或 1:200）的原接种液作倾注平板，培养 4872 小时后计数菌落数，即可得到抗菌药物的最小杀菌浓度。5、 质量控制 对于常见需氧菌和兼性厌氧菌，M-H 琼脂，孵育时间、环境、质控菌株同纸片扩散法。（二） 琼脂稀释法琼脂选择法是将药物混匀于琼脂培养基中，配制含不同浓度药物平板，使用多点接种器接种细菌，经孵育后观察细菌生长情况，以抑制细菌生长的琼脂平板所含药物浓度测得MIC。1、 培养基 M-H 琼脂为一般细菌药敏试验的最佳培养基，调整 pH 在 7.27.4，pH 的过高或过低会影响药物效能。2、 含药
9、琼脂制备 将已稀释的抗菌药物按 1:9 加入在 4550水浴中平衡融化 M-H 琼脂中，充分混合倾入平皿，琼脂厚度为 34mm。室温凝固后的平皿装入密封塑料袋中，置 28，贮存日期为 5 天，对易降解药物如头孢克洛，在使用 48 小时之内制备平板，使用前在室温中平衡，放于温箱中 30 分钟使琼脂表面干燥。3、 细菌接种 将 0.5 麦氏比浊度菌液稀释 10 倍，以多点接种器吸取（约为 12l）接种于琼脂表面，稀释的菌液于 15 分钟内接种完毕，使平皿接种菌量为 1 x104CFU/点。接种后置 35 孵育 1620 小时，特殊药需要 24 小时。奈瑟菌属、链球菌属细菌置于5%CO2，幽门螺杆菌
10、置微需氧环境中孵育。4、 结果判断 将平板置于暗色、无反光表面上判断试验终点，以抑制细菌生长的药物稀释度为终点浓度。药敏试验的结果报告可用 MIC（g/ml）或对照 CLSI 标准用敏感（S） 、中介（I）和耐药（R）报告。有时对于稀释法的批量试验，需要报告 MIC50、MIC90.MIC50 是指抑制 50%试验菌的最低药物浓度， MIC90 是指抑制 90%试验菌株的最低药物浓度，例如被测大肠埃希菌 100 株，抗菌药物为头孢哌酮，在 8g/ml 时可抑制 90 株大肠埃希菌生长，此时头孢哌酮对大肠埃希菌的 MIC90 是 8g/ml。三、E-testE-test 法（ epsilomet
11、er test）是一种结合稀释法和扩散法原理对抗菌药物药敏试验直接定量的药敏试验技术。1.原理 E 试条是一种 5mmx50mm 的无孔试剂载体，一面固定有一系列预先制备的，浓度呈连续指数增长稀释抗菌药物，另一面有读数和判别的刻度。抗菌药物的梯度可覆盖有 20个 MIC 对倍稀释浓度的宽度范围，其斜率和浓度范围对判别有临床意义的 MIC 范围和折点具有较好的关联。将 E 试条放在细菌接种过的琼脂平板上，经孵育过夜，围绕试条明显可见椭圆形抑菌圈，其边缘与试条交点的刻度即为抗菌药物抑制细菌的最小抑菌浓度。2、 培养基 需氧菌和兼性厌氧菌：M-H 琼脂；MRSA/MRSE：M-H 琼脂+2%NaCl
12、; 肺炎链球菌：M-H 琼脂+5%脱纤维羊血；厌氧菌：布氏杆菌血琼脂；嗜血杆菌：HTM；淋病奈瑟菌：GC+1%添加剂。3、 细菌接种 对于常见需氧菌和兼性厌氧菌，使用厚度为 4mmM-H 琼脂平板，用 0.5 麦氏浓度的对数期菌液涂布，待琼脂平板完全干燥，用 E 试条加样器或镊子将试条放在已接种细菌的平板平面，试条全长应与琼脂平板紧密接触，试条 MIC 刻度面朝上，浓度最大处靠平板边缘。4、 结果判断和报告 读取椭圆环与 E 试验试条的交界点值，即为 MIC。问与答：1. 何为药物敏感性试验？其目的是？测定抗感染药物在体外对病原微生物有无抑菌或杀菌作用的方法称为药物敏感性试验（antibiot
13、ic susceptibility test ） ，简称药敏试验（AST） 。药敏试验的目的是检测可能引起感染的细菌对一种或多种抗菌药的敏感性。事实上，体外药敏试验是对一种抗菌药在体内治疗有效性预测的先决条件，可供临床医生在治疗患者时合理选择用药。此外，药敏试验还可监测细菌耐药性变化。通过对某一病房、医疗机构、地区或国家的细菌耐药性进行流行病学追踪，调整他们的经验用药规程，定期修订临床抗菌谱内容，可为医院制定预防措施提供依据。2. 何为 CLSI?我国药敏试验结果判断参照哪个标准？CLSI 指的是临床实验室标准化研究所（Clinical and Laboratory Standards Ins
14、titute）(以前称NCCLS)，是一个国际性的、学科间的、非盈利性的、制定标准的教育机构，它促使人们对标准和指南达成共识并促进其在医疗保健系统内的应用。在为临床试验与相关的医疗问题制定标准和指南时，CLSI 实施了它所特有的达成一致的过程，因而得到全世界的认可。若要经济而有效的提供临床试验和医疗保健水平，就应该具备一致的标准，这便是 CLSI的原则基础。目前，我国药敏试验结果判断标准参照 CLSI 标准文件，CLSI 文件是我国的卫生部部颁文件。3. 药敏试验报告中的 S、I、R 分别表示什么意思？S:敏感（susceptible，S） ，当一种细菌引起的感染，用某种药物的常规量时治疗有效
15、，这种细菌即对该药高度敏感。即常规用药时达到的平均血药浓度为对细菌的最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration,MIC）的 5 倍或以上。I:中度敏感（intermediate，I） ，当细菌引起的感染仅在应用高剂量抗菌药时有效，或者细菌处于体内抗菌药浓缩的部位或体液（如尿、胆汁、肠腔等）中时才被抑制，这种细菌对该药仅呈中度敏感。通常用药时达到的平均血药浓度一般相当于或略高于对细菌的 MIC。对于毒性较小的药物，可适当加大剂量仍可望获得临床疗效。R:耐药（ resistant，R） ，药物对某一细菌的 MIC 高于药物在血或体液内可能达到的浓度时，或有时细菌
16、能产生灭活抗菌药的酶，则无论其 MIC 值大小如何，仍应判定该菌为耐药。例如产青霉素酶的金黄色葡萄球菌即应认为该菌对青霉素耐药。12.什么情况下需要做药敏试验？已查明病原菌，需要帮助医师选择最合适的抗菌药物者为进行细菌耐药性监测和了解本地区的耐药性变迁，必须有细菌药敏测定结果以建立细菌耐药性数据库新抗菌药物的药效学评价，必须进行药敏测定以获得该药的 MIC50 和 MIC90，MIC50 和 MIC90 以及抑菌率等评价指标。以下情况不需要做药敏测定：已知某些抗菌药物对某种细菌有良好的抗菌作用，而且很少有耐药株存在，例如溶血性链球菌和脑膜炎奈瑟球菌等可能是污染菌而不是引起发病的真正病原菌对一些营养要求较高，不易生长的细菌，一般也可不做常规药敏测定，例如淋病奈瑟球菌和流感嗜血杆菌。必要时可进行有计划的调查研究。1. 什么是纸片扩散法？其原理是？纸片扩散法试验就是 Kirby-Bauer(K-B)试验，是临床微生物实验室最
