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1、酶工程研究及其新进展生物技术及应用 王伟 20090708018【摘要】酶的生产和应用的技术过程称为酶工程。其主要任务是通过预先设计，经人工操作而获得大量所需的酶，并利用各种方法使酶发挥其最大的催化功能。本文意在阐述近年来酶工程在分子水平的研究进展，展示酶工程在医药、化工、食品、环境保护等领域的应用进展，并对其未来前景进行了展望。【关键词】酶工程；研究；应用；进展在 20 世纪中，物理、化学、数学、信息科学广泛而又深入地渗入生物学，促使生物学发生了全面而又彻底的变化，开创了全新的分子生物学，使生物学成为生命科学基础研究的中心学科。在分子生物学的推动下，20 世纪 70 年代，以基因工程为代表的
2、高新技术生物技术的出现，进而形成庞大的生物工程产业，对人类经济生活和社会生活产生了重大影响。酶工程是生物技术的一个重要组成部分。酶工程又称酶反应技术，就是指在一定的生物反应器内，利用生物酶作为催化剂，使某些物质定向转化的工艺技术。其应用范围已遍及工业、医药、农业、化学分析、环境保护、能源开发和生命科学理论研究等各个方面。与此同时，酶工程产业也在快速发展。1998年全世界工业酶制剂销售额高达 16 亿美元。预计到 2008 年，销售额将达到 30亿美元。近年来，美国、欧洲共同体国家和日本，在酶工程研究和酶工程产业方面发展非常迅速，仍然居于领先地位。运用基因工程技术可以改善原有酶的各种性能，如提高
3、酶的产量、增加酶的稳定性、使酶适应低温环境、提高酶在有机溶剂中的反应效率、使酶在后提取工艺和应用过程中更容易操作等。运用基因工程工程技术也可以将原来由有害的、未经批准的微生物产生的酶的基因，或由生长缓慢的、动植物产生的酶的基因，克隆到安全的、生长迅速的、产量很高的微生物体内，改由微生物来生产。运用基因工程工程技术还可以通过增加编码该酶的基因的拷贝数，来提高微生物产生的酶的数量。这一原理已成功地应用于酶制剂的工业生产。目前，世界上最大的工业酶制剂生产厂商丹麦诺维信公司 (Novozymes，由原诺和诺德公司酶制剂部独立而成)。生产酶制剂的菌种约有 80 %是基因工程菌。1.分子酶的研究进展分子酶
4、工程学就是采用基因工程和蛋白质工程的方法和技术，研究酶基因的克隆和表达、酶蛋白的结构与功能的关系以及对酶进行再设计和定向加工，以发展更优良的新酶或新功能酶。1.1 酶分子的定向改造和进化分子酶工程设计可以采用定点突变和体外分子定向进化两种方式对天然酶分子进行改造。体外定向进化是近几年新兴的一种蛋白质改造策略，可以在尚不知道蛋白质的空间结构，或者根据现有的蛋白质结构知识尚不能进行有效的定点突变时，借鉴实验室手段在体外模拟自然进化的过程(随机突变、重组和选择)，使基因发生大量变异，并定向选择出所需性质或功能，从而使几百万年的自然进化过程在短期内得以实现。此目前采用体外分子定向进化的方法来改造酶蛋白
5、的研究越来越多，并已在短短几年内取得了令人瞩目的成就，易错 PCR 和 DNA 改组就是其中 2 种方法。1.2 融合蛋白与融合酶蛋白质的结构常常可以允许某个结构域的插入与融合。DNA 重组技术的发展与应用使不同基因或基因片段的融合可以方便地进行，融合蛋白经合适的表达系统表达后，即可获得由不同功能蛋白拼合在一起而形成的新型多功能蛋白。目前，融合蛋白技术已被广泛应用于多功能工程酶的构建与研究中，并已显现出较高的理论及应用价值。随着基因组、后基因组时代的到来和重组酶生产技术的开发，必将会有大量的、新的酶蛋白被人类发现。1.3 人工合成酶和模拟酶酶的高度催化活性以及酶在工业上应用带来的巨大经济效益，
6、促使人们研究人工合成的酶型催化剂。通常，人们将人工合成的具有类似酶活性的高聚物称之为人工合成酶(synzymes)。人工合成酶在结构上必须具有两个特殊部位，即一个是底物结合位点，一个是催化位点。业已发现，构建底物结合位点比较容易，而构建催化位点比较困难，两个位点可以分开设计。但是后又发现，如果人工合成酶有一个反应过渡态的结合位点，则该位点常常会同时具有结合位点和催化位点的功能。人工合成酶通常也遵循 MichaelisMenten 方程。例如。高分子聚合物聚 4乙烯基吡啶烷化物，具有糜蛋白酶的功能，含辅基或不含辅基的高分子聚合物，具有氧化还原酶、参与光合作用的酶和各种水解酶等功能。在模拟酶(en
7、zymemimics)方面，固氮酶的模拟最令人瞩目。人们从天然固氮酶由铁蛋白和铁钼蛋白两种成分组成得到启发，提出了多种固氮酶模型。如过渡金属(铁、钴、镍、等 )的氮络合物，过渡金属 (钒、钛等)的氮化物，石墨络合物，过渡金属的氨基酸络合物等。此外，利用铜、铁、钴等金属的络合物，可以模拟过氧化氢酶等。近来，国际上又发展起一种分子压印(molecularimprinting)技术，又称为生物压印(bioimprinting)技术。该技术可以借助模板在高分子物质上形成特异的识别位点和催化位点。目前，此项技术已经获得广泛的应用。例如，模拟酶可用于催化反应，分子压印的聚合物可用作特制的分离材料，抗体和受
8、体结合位点的模拟物可用于识别和检测系统，分子压印的聚合物可用作生物传感器的识别单元等。Wandrey 在第 14 届国际酶工程会议上所作的主旨演讲中，介绍了人工合成酶在氧化还原反应方面的进展。他将天然酶和人工合成酶置于膜反应器内，比较了二者在连续氧化还原反应系统中的反应能力。天然酶的转换频率(turnoverfrequency，TOF)迄今为止仍然高于人工合成酶。而人工合成酶的空间时间产率(Spacetimeyield，STY)，可以大大高于天然酶催化的反应。在使用有机溶剂和各式各样不同的底物方面，人工合成酶也要比天然酶优越得多。1.4 核酸酶和抗体酶近年来，人们发现除去蛋白质具有酶的催化功能
9、以外，RNA 和 DNA 也具有催化功能。1982 年 Cesh 发现四膜虫的 26SrRNAd 的前体，在没有蛋白质存在的情况下，能够进行内含子的自我剪接，形成成熟的 rRNA，证明 RNA 分子具有催化功能，并将其称为核酸酶(ribozyme，有人译为核酶)。1995 年 Cuenoud 又发现某些 DNA 分子也具有催化功能。这就改变了只有蛋白质才能有催化功能的传统观念，也为先有核酸，后有蛋白质，提供了进化的证据。进一步的研究发现核酸酶是一种多功能的生物催化剂，仅可以作用于 RNA 和 DNA，而且还可以作用于多糖、氨基酸酯等底物。核酸酶还可以同时具有信使编码功能和催化功能，实现遗传信息
10、的复制、转录和翻译，是生命进化过程中最简单、最经济、最原始的、催化核酸自身复制、加工的方式。核酸酶具有核苷酸序列的高度专一性。这种专一性使核酸酶具有很大的应用价值。只要知道某种核酸的核苷酸序列，就可以设计并合成出催化其自我切割和断裂的核酸酶。我们知道，动植物病毒的基因组由核酸组成。根据这些基因组的全部序列，就可设计并合成出防治有这些病毒引起的人、畜和植物病毒病的核酸酶，如能够防治流感、肝炎、艾滋病和烟草花叶病等。核酸酶也可以用来治疗某些遗传病和癌症，核酸酶还可以用作研究核酸图谱和基因表达的工具。一般说来，人工合成的模拟酶与天然酶的催化效率相差较大，而且，反应类型大都为水解反应。人们从酶与底物过
11、渡态中间物紧密结合是酶催化过程中的关键一步得到启发，联想到抗原引起生物体内抗体的合成，以及抗原和抗体的紧密结合。进而考虑利用抗原抗体相互作用的原理来模拟酶的催化作用。人们设想以一些底物过渡态中间物的类似物作为半抗原，诱导合成与其构象互补的相应的抗体，试图得到能够催化上述物质进行活性反应的酶。1986 年这种努力在实验室里获得了成功，为人工合成酶和模拟酶，开创了一条崭新的途径。人们将这种具有催化活性的抗体称为抗体酶 (abzyme)，又称催化抗体(catalyticantibody)。抗体酶在本质上是免疫球蛋白，人们在其易变区赋予了酶的催化活性。抗体是目前已知的最大的多样性体系。原始抗体大家族有
12、 1 108个结合部位，体细胞变异还可以增加 1 104 个结合部位。抗体有极高的亲和力，解离常数为 10 - 4 10 - 14mol/L，其与抗原结合的结合部位与酶的结合部位相似，但无催化活性，抗体酶则具有较高的催化活性。制备抗体酶的方法主要有诱导法、拷贝法、插入法、化学修饰法和基因工程法。抗体酶的催化效率远比模拟酶高，同时从原理上讲，只要能找到合适的过渡态类似物，几乎可以为任何化学反应提供全新的蛋白质催化剂 - 抗体酶。目前抗体酶催化的反应，除水解反应外，还能催化合成反应交换反应，闭环反应，异构化反应、氧化还原反应等。此外，与模拟酶相比，抗体酶表现出一定程度的底物专一性和立体专一性。抗体
13、酶的应用前景非常诱人，抗体酶已经用于酶作用机理的研究，手性药物的合成和拆分，抗癌药物的制备。2.酶工程的应用进展2.1 活性多肽的开发研究近年来，人们利用酶工程技术来开发功能性活性肽取得了很大的进展。生物活性肽是蛋白质中 20 种天然氨基酸以不同排列组合方式构成的从二肽到复杂的线性或环形结构的不同肽类的总称，是源于蛋白质的多功能化合物。活性肽具有多种人体代谢和生理调节功能，易消化吸收，有促进免疫、激素调节、抗菌、抗病毒、降血压、降血脂等作用，且食用安全性极高。生物活性肽主要是通过化学法或酶法降解蛋白质而制得。其中，酶法降解蛋白质生产活性多肽安全性极高，能在温和的条件下进行定位水解分裂产生特定的
14、肽，且水解过程易控制，因而近几年报道的活性肽的制备方法皆为酶解法。目前已从酪蛋白、乳清蛋白、大豆蛋白、玉米蛋白、水产蛋白的酶解物中制得一系列功能各异的生物活性肽。2.2 酶工程在医药方面的研究进展(1)生产抗生素应用酶工程可以制备 6- APA青霉素酰化酶、 7- ACA头孢菌素酰化酶、头孢菌素头孢菌素酰化酶 、 7- ADCAE青霉素 V 酰化酶、脱乙酰头孢菌素头孢菌素乙酸酯酶，近年来还进行固定化产黄青霉细胞生产青霉素的研究，合成青霉素和头孢菌素前体物的最新工艺也采用酶工程的方法。(2)生产氨基酸和有机酸生产尿酐酸、L- 酪氨酸及 L- 多巴、L- 天冬氨酸、 L- 苯丙氨酸、L-谷氨酸、L
15、- 丝氨酸、 L- 色氨酸、天冬酰胺、谷胱甘肽等有机酸。(3)生产维生素制造 2- 酮基- L- 古龙糖酸 山梨糖脱氢酶及 I- 山梨糖醛氧化酶、肌醇 肌醇合成酶、 L- 肉毒碱 EN 碱酯酶 、 CoACoA 合成酶系等。由山梨醇和葡萄糖生产维生素及丙烯酰胺的生产也采用酶工程的方法。(4)生产核苷酸类药物腺嘌呤核苷酸(AMP)由产蛋白假丝酵母菌体用热水提取核酸，再经核酸酶水解制得。脱氧核苷酸由鱼白提取脱氧核糖核酸(DNA)后，经 5 - 磷酸二酯酶酶解制得。先由富含核酸的动植物(花粉等) 提取核糖核酸 (RNA)，再用 5- 磷酸二酯酶酶解为磷酸腺苷 (AMP)、磷酸胞苷(CMP) 、磷酸尿
16、苷(UMP) 及磷酸鸟苷(GMP)制得混合核苷酸。肌苷酸由腺苷脱氨酶制得。ATP 和 AMP 分别由氨甲酰磷酸激酶、激酶加乙酸激酶制得。2.3 在污染治理中的应用(1)辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶是酶处理废水领域中应用最多的一种酶。有过氧化氢存在时，它能催化氧化多种有毒的芳香族化合物，其中包括酚、苯胺、联苯胺及其相关的异构体，反应产物是不溶于水的沉淀物。(2)木质素过氧化物酶木质素过氧化物酶，也叫木质素酶，是 Phanerochaetechrysosporium 白腐真菌细胞酶系统的一部分。它可以处理很多难降解的芳香族化合物和氧化多种多环芳烃、酚类物质。(3)漆酶漆酶由一些真菌产生，通过聚合反应去除有毒酚类。而且，由于它的非选择性，能同时减少多种酚类的含量。漆酶的去毒功能与被处理的特定物质、酶的来源及一些环境有关。(4)氰化物酶氰化物酶氰化物酶能把氰化物转变为氨和甲酸盐，因此是一步反应历程。一种革兰氏阴性菌，可产生氰化物酶，该酶有很强的亲合力和稳定性，且能处理的氰化物质量浓度低于
