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1、1红霉素和阿伦磷酸钠防治人工关节松动动物实验研究作者：陶崑，沈灏，张先龙，王琦，邵俊杰，彭晓春【摘要 】 目的应用植骨气囊模型观察红霉素和阿伦磷酸钠防治人工关节松动的效果。 方法应用 8 10 周大的 BALB/c 小鼠建立气囊模型，气囊成熟后在气囊内植入同基因小鼠颅骨，同时在气囊内注入超高分子聚乙烯颗粒。实验分 4 组：空白组气囊和腹腔均注射生理盐水（阴性对照） ；颗粒刺激组气囊注射聚乙烯颗粒，腹腔注射生理盐水（阳性对照） ；红霉素组气囊注射聚乙烯颗粒，腹腔注射红霉素；阿伦磷酸钠组气囊注射聚乙烯颗粒，腹腔注射阿伦磷酸钠。14 d 后处死，取囊壁和植入颅骨组织进行组织形态学和分子生物学检测。
2、结果红霉素和阿伦磷酸钠组破骨细胞激活均受抑制，两者无显著差别。但红霉素组 IL-1、TNF 和 VEGF 含量明显下降，气囊炎性反应减轻，而阿伦磷酸钠无此抗炎作用。 结论本试验证明红霉素和阿伦磷酸钠均有可能成为延缓和治疗人工关节松动的药物。 【关键词】 红霉素； 阿伦磷酸钠； 植骨气囊； 动物模型； 溶骨； 人工关节松动2Abstract: ObjectiveTo observe whether erythromycin and alendronate are effective in treating aseptic loosening in a murine osteolysis mode
3、l. MethodAir pouches were established in the back of BALB/c mice by injecting sterile air subcutaneously. After the air pouches were mature, grafts of calvaria from syngeneic mouse donors were implanted in the air pouches and polyethylene debris was injected into the air pouches. Mice were divided i
4、nto 4 groups. In the first group, saline was injected into the air pouches.In the other three groups, polyethylene debris was used. Saline,erythromycin and alendronate were injected intraperitoneally separately.Pouch tissues were collected at 14 days after polyethylene debris administration for mole
5、cular and histologic analysis.Result Both erythromycin and alendronate inhibited osteoclastogenesis and bone resorption, but alendronate was not as effective as erythromycin in anti-inflammation.Conclusion Both erythromycin and alendronate can be promising drugs for the treatment of aseptic loosenin
6、g.Key words：erythromycin; alendronate; air pouch; animal model; osteolysis; aseptic loosening3人工关节无菌性松动是人工关节置换术的主要并发症，它严重阻碍了人工关节的推广应用。以前的研究大都是通过假体的设计、假体的材料和手术技巧等方面来降低松动的发生。最近的研究是在分子水平模仿人工关节松动的发生过程，应用药物来减少松动的发生。目前临床上还没有统一的预防和治疗人工关节松动的药物。本试验通过小鼠植骨气囊模型来观察大环内酯类抗生素红霉素和二磷酸盐阿伦磷酸钠的治疗人工关节松动的效果。1 药物、材料和方法1.1
7、红霉素和阿伦磷酸钠红霉素标准品（上海市食品药品检验所） ；阿伦磷酸钠标准品（石家庄制药集团）1.2 聚乙烯颗粒聚乙烯颗粒由上海市中科院物理研究所提供，应用激光衍射法粒度分析仪和电子显微镜分析颗粒平均直径 8.887 m。用 70%的乙醇溶液反复冲洗颗粒，并浸泡 24 h 后用生理盐水洗去酒精，制成生理盐水的悬浮液，浓度为 10 mg/ml。41.3 实验动物实验选用近交系雌性 BALB/c 小鼠 40 只，年龄 810 周，体重20 g（上海中科院动物实验中心） 。处死 8 只小鼠，取其颅骨作为其它小鼠气囊植骨的供体。将剩余 32 只小鼠随机分为颗粒刺激组、空白对照组、红霉素组和阿伦磷酸钠组，
8、各 8 只。1.4 植骨气囊模型1.4.1 小鼠气囊模型在小鼠背部选择大约 2 cm2 cm 大小的皮肤，用酒精消毒，去毛。用 25 号针头和 3 ml 注射器在同一个位置，分别于第 1，3，5 d，皮下注射 1 ml 无菌空气，共注射 3 ml 形成皮下气囊。第 7 d气囊形成。1.4.2 取小鼠颅骨腹腔麻醉后断颈处死小鼠，在无菌条件下正中切开皮肤，分离小鼠颅骨骨片，将每侧颅骨修整成为 4 mm3 mm 的骨片，去处周围软组织。注意勿损伤骨表面骨膜。取出的骨组织放置于无菌的生5理盐水中，准备植入。1.4.3 气囊植骨对气囊小鼠进行腹腔麻醉。在气囊上做一个 5 mm 长的切口，植入准备好的颅骨
9、骨片；用 40 的聚丙烯缝线缝合切口。整个过程严格在无菌条件下进行。1.5 术后处理24 h 后，空白对照组气囊注射 0.5 ml 生理盐水；颗粒刺激组、红霉素组和阿伦磷酸钠组小鼠气囊内分别各注射含 5 mg 聚乙烯颗粒和 0.5 ml 的 10%生理盐水悬浮液，以刺激发炎反应和溶骨反应。在颗粒注射前 1 d，红霉素组小鼠按照每天每公斤体重 2 mg 的剂量，阿伦磷酸钠组按照每天每公斤体重 0.2 mg 的剂量腹腔注射给小鼠，颗粒组小鼠每天腹腔注射同等剂量（0.2 ml）生理盐水，14 d 后处死所有小鼠，在无菌条件下取出颅骨和周围囊壁组织进行组织细胞学和分子生物学的检测。1.6 检测方法1.
10、6.1 HE 染色6原位采集气囊和颅骨组织，保护软组织和颅骨界面不受破坏。HE 染色组织切片观察囊壁炎性反应和植入颅骨的表面侵蚀情况。炎性反应主要观察：囊壁的厚度和炎性细胞的渗出数量。每个标本采集 4 个不同的地方进行分析。囊壁的厚度是通过测量囊壁上 6 个不同的位置平均计算得到的。总细胞计数是通过测量细胞核的数目得到的。1.6.2 抗酒石酸酸性磷酸酶染色（TRAP）破骨细胞表达特异性的酒石酸酸性磷酸酶，TRAP 染色是破骨细胞的特异性染色，可以用来观测破骨细胞的激活情况。使用的是国际标准化白血病细胞化学染色诊断试剂盒。将取下的囊壁和颅骨组织做快速冰冻切片，切片厚度为 68 m,后按照试剂盒要
11、求染色。胞浆染色呈现深紫色就是 TRAP 阳性破骨样细胞。在冰冻切片中分离单个 TRAP 阳性细胞比较困难，总的破骨样细胞的数量是通过软件分析深紫色细胞浆在每个高倍镜视野下所占的累计面积。1.6.3 ELISA 测量细胞因子 IL-1、TNF 和 VEGF 含量将气囊壁和骨组织制成组织匀浆，并提取其上层清液检验 IL-1、TNF 和 VEGF 蛋白的含量。试剂盒从 R&D 公司购买，整7个实验按照标准的流程进行。1.6.4 RT-PCR 测量破骨细胞表面 RANK（NF-B 受体活化因子）的 mRNA 含量引物：Rank F:5-caa ctc gac aga tcg cta ca-3R:5-
12、acg tag acc acg atg atg tcg c-3(315bp)GAPDH F:5-acc aca gtc cat gcc atc ac-3R:5-tcc acc acc ctg ttg ctg ta-3(450bp)PCR 反应在 25 l 体系中进行，体系含有 10 mmol/L 核苷酸磷酸(dNTP) 0.5 l， 10 mmol/L 上下游引物各 2 l，cDNA2 l，Taq DNA 聚合酶（ TOYOBO 公司）1 l（5 U/l） 。PCR 反应首先 95预变性 5 min 后开始循环，循环条件 95 30 s，60 30 s,72 30 s,35 个循环，最后 72
13、延伸 10 min。产物电泳分离，测量灰度，目的基因的灰度与管家基因 GADPH 的灰度进行比对得到目的基因的相对表达量。1.7 统计学分析8数字图像利用 Image Pro Plus 5.0（IPP）软件来分析。组间比较应用方差分析的方法，使用的软件是 SPSS 10.0 版本。P 值小于0.05 表示有显著差异。数据的表达均使用均数标准误差的形式。2 结果2.1 一般情况由于基因同源性高，植入颅骨骨片免疫耐受性较好，32 只BALB/c 小鼠植骨后无 1 例感染出现，伤口均一期愈合。2.2 大体标本观察聚乙烯颗粒是明显的致炎颗粒。大体肉眼观察可见：空白对照组和红霉素组小鼠气囊囊壁炎性反应不
14、明显，阿伦磷酸钠组其次，颗粒刺激组炎性反应最明显。2.3 组织细胞学观察2.3.1 HE 染色镜下可见：空白对照组（图 1）囊壁炎性细胞渗出不明显，颅骨9表面无明显溶骨；颗粒刺激组（图 2）炎性细胞渗出增多，颅骨表面可见较多点状侵蚀；红霉素组（图 3）和阿伦磷酸钠组（图 4）颅骨表面无明显侵蚀，但红霉素组炎性渗出不明显而阿伦磷酸钠组囊壁炎性细胞渗出较明显。图像分析统计，小鼠囊壁炎性细胞渗出数结果如下：空白对照组（5 820598）mm2，红霉素组（6 66597）mm2，阿伦磷酸钠组（8 519167）mm2，颗粒组（8 729164）mm2；红霉素组和空白组较颗粒组和阿伦磷酸钠组相比细胞渗出
15、明显减少，差异显著（P0.05） ；红霉素组和阿伦磷酸钠组差异显著（P0.05） ；阿伦磷酸钠组和颗粒组无明显差异（P0.05） 。小鼠囊壁厚度统计结果如下：空白对照组（839） m，红霉素组（828） m，阿伦磷酸钠组（14511 ） m，颗粒组（14915 ） m；颗粒组和阿伦磷酸钠组较红霉素组和空白组相比囊壁明显增厚，差异显著（P 0.05） ；红霉素组和空白组差异不显著；阿伦磷酸钠组和颗粒组差异不显著。2.3.2 TRAP 染色在植入骨和囊壁的界面是破骨细胞激活的位置，图 5 至图 8 分别是空白组、颗粒刺激组、红霉素组和阿伦磷酸钠组的 TRAP 染色情况，图中深紫色区域就是破骨细胞激
16、活的位置，可见颗粒组染色10最深，阳性染色面积区域最大；红霉素组和阿伦磷酸钠组介于空白组和颗粒组之间。图像分析结果，红霉素组，阿伦磷酸钠的染色面积和空白组、颗粒组的染色面积差异显著（P0.05） ；红霉素组和阿伦磷酸钠组之间无显著差异（P0.05） 。 图 1 空白对照组 图 2颗粒刺激组(HE 染色可见颗粒组炎性细胞渗出增多，囊壁变厚，颅骨表面可见明显的骨溶解反应) 图 3 红霉素组 图 4 阿伦磷酸钠(HE染色可见红霉素组和阿伦磷酸钠组颅骨表面骨溶解反应受抑制。红霉素炎性反应明显受到抑制，而阿伦磷酸钠组不明显)图 5 空白对照组 图 6 颗粒刺激组(TRAP 染色可见颗粒组颅骨和囊壁界面有大量的破骨细胞阳性染色区域)图 7 红霉素组 图 8 阿伦磷酸钠组 2.4 分子生物学观察2.4.1 ELISA 测量结果ELISA 结果（表 1 所示） ，红霉素有明显的
