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1、1硫磺熏蒸对菊花中有效成分含量影响研究作者：赵清，马晓莉，郝丽静，陈玮娜【摘要 】 目的考察硫熏干燥对菊花中有效成分的含量影响。方法采用 HPLC 法测定自然干燥和硫磺熏蒸干燥菊花中绿原酸、槲皮素、木犀草素的含量；采用分光光度法测定菊花中总黄酮的含量；采用盐酸副玫瑰苯胺法测定各菊花中 SO2 的残留量。结果与自然干燥的菊花相比，硫熏菊花中的槲皮素、木犀草素和总黄酮含量低于前者，而绿原酸含量高于前者， SO2 的残留量远远高于前者。结论硫磺熏蒸对菊花中有效成分的含量变化有一定的影响，建议产地加工时应限制使用硫熏干燥法。 【关键词】 菊花； 硫熏干燥； 绿原酸； 槲皮素； 木犀草素； 总黄酮菊花是
2、菊科植物菊花 Chrysanthemum morifolium Ramat 的干燥头状花序,为我国常用中药，具有疏风、清热、明目、解毒之功效。临床上主要用于治疗头痛、眩晕、目赤、心胸烦热、疔疮肿毒等症。目前市售的菊花多采用硫磺熏蒸的方法加以干燥，以达到漂泊、美化外观和防霉生虫等目的。但硫磺熏蒸后的药材是不利于入药的，因为其中残留的亚硫酸盐会对人体造成咽喉疼痛、胃部不适2等伤害。此外，熏蒸后产生过多的 SO2 也会对大气造成严重污染。为考察硫磺熏蒸对菊花中绿原酸和黄酮类化合物含量的影响，今对自然干燥菊花与硫熏菊花中绿原酸、槲皮素、木犀草素及 SO2 的残留量进行了含量测定研究，为菊花资源的科学应
3、用提供参考。1 仪器与材料1.1 仪器戴安 UltiMate 3000 高效液相色谱仪, UltiMate 3000 四元泵，UltiMate 3000 variable wavelength 检测器，Chameleon 工作站，KQ-250B 超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司） ，Spectrum922E 型分光光度计。1.2 材料白菊花采自河北安国祁药标准化种植基地。芦丁对照品（100080-200707 ） 、绿原酸对照品（110753-200403 ） 、木犀草素对照品（111720-200603 ） 、槲皮素对照品（100081-200406）均购自中国生物制品检定所。甲醇采用色
4、谱醇，水为重蒸馏水，其余均为分析醇。2 方法与结果2.1 硫磺熏蒸菊花的制备将新采摘的菊花头状花序摊放于直径为 90cm 的带有支架的尼龙丝网圆筛中，把自制的体积约 1.26 3m3 聚氯乙稀罩自上而下套在外面，距地面约为 10 cm。将适量的硫磺置于陶瓷器皿中，点燃后迅速推入到垂直于圆筛的下方地面上，待其燃烧完全后，将聚氯乙稀罩下调至和地面充分接触，形成密封环境，保存 12 h 后取出，通风至干，备用。2.2 绿原酸的含量测定 12.2.1 色谱条件及系统适用性色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂； 0.1 mol/L 磷酸二氢钠溶液 -甲醇（7030）为流动相；检测波长 328 nm，流速
5、 1 ml/min。此条件下绿原酸的保留时间为 6.61 min。2.2.2 对照品溶液的制备精密称取绿原酸对照品适量，置于棕色量瓶中，加水制成 64 g/ml，即得。2.2.3 供试品溶液的制备取菊花粉末约 2 g，精密称定，置锥形瓶中，精密加入甲醇 100 ml，称定质量，加热回流 2 h，冷却，再称定质量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液 5 ml，蒸干，残渣加入氯仿 5 ml，浸 3 min，弃去，加水适量溶解，转移至 10 ml 量瓶中，加水至刻度，摇匀，微孔滤膜滤过，即得。42.2.4 标准曲线的制备分别精密吸取对照品品溶液0.5，1.0，1.5，2.0，3.0 m
6、l，定容至 10 ml，摇匀。吸取以上溶液80 l，注入液相色谱仪，定量 20 l 测定。以峰面积对浓度进行回归，得回归方程：Y=1 085.824 67X -1.339 89（R=0.999 6） ，表明绿原酸在浓度 0.0640.382 mg/ml 范围内线性关系良好。2.2.5 精密度实验取供试品溶液，重复进样 5 次，记录绿原酸的峰面积，计算 RSD=1.21%，表明精密度良好。2.2.6 重复性实验精密称取供试品 5 份，按“2.2.3”项下方法分别制成供试品溶液，进样分析，记录绿原酸峰面积，结果RSD=1.67%，结果表明本法重复性良好。2.2.7 稳定性实验取同一份供试品溶液，分
7、别在0，2 ，4 ， 6，8 h 测定，记录绿原酸峰面积，计算 RSD=1.33%，表面样品在 8h 内稳定。2.2.8 回收率实验精密称取供试品 1.0 g，按高、中、低分别加入绿原酸，照“2.2.3”项下方法制备、测定，测得绿原酸平均回收率为 97.51%，RSD=1.98%。2.2.9 样品的测定分别精密称取各种样品，按“2.2.3”项下5方法，制成供试品溶液，注入高效液相色谱仪进行测定，记录绿原酸的峰面积，计算含量。结果见表 1。表 1 各菊花中绿原酸含量测定结果（略）2.3 槲皮素与木犀草素的含量测定22.3.1 色谱条件及系统适用性试验十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相是甲醇-水
8、（6040 ） ，用磷酸调 pH 值为 3；检测波长 253 nm，流速 1 ml/min。此条件下槲皮素的保留时间为8.97 min，木犀草素的保留时间为 10.72 min。2.3.2 对照品溶液的制备称取干燥至恒重的槲皮素与木犀草素对照品适量，用甲醇溶解，定容至 50 ml，得质量浓度分别为0.016 4，0.018 mg/ml 混合对照溶液，备用。2.3.3 供试品溶液的制备精密称取菊花粉末 1 g，置锥形瓶中，加 70%乙醇 30 ml 在 60恒温水浴温萃 30 min，冷却，抽滤，洗涤至 100 ml 量瓶中，用 70%乙醇定容至刻度，摇匀。精密吸取 5 ml 溶液，加入 1ml
9、 浓度为 4 mol/L 的盐酸于 80 恒温水浴水解1h。用 70%乙醇定容至 10 ml，微孔滤膜滤过，即得。2.3.4 线性关系的考察精密吸取对照品溶液 1，2 ，4，6，8 6ml 定容至 10 ml。吸取上述溶液，注入液相色谱仪，定量 20 l，分析测定。以进样浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程：槲皮素为 Y=1 584.431 7X+0.703 87(R=0.999 4)；木犀草素为 Y=376.668 1X+0.581 2(R=0.999 6)，说明槲皮素在0.32813.12 g/ml 浓度范围，木犀草素在 0.3614.44 g/ml浓度范围内线性关系良好
10、。2.3.5 精密度实验取供试品溶液，重复进样 5 次，分别记录槲皮素和木犀草素峰面积， 计算 RSD 分别为 1.86% 和 1.91%，表明精密度良好。2.3.6 重复性实验精密称取供试品 5 份，按“2.3.3”项下方法分别制成供试品溶液，进样分析，记录槲皮素和木犀草素峰面积，结果 RSD 分别为 1.89%和 1.77%，结果表明本法重复性良好。2.3.7 加样回收率实验取一样品粉末，精密称取 5 份，分别加入混合标准溶液 1 ml，按“2.2.3” 项下方法制备、测定，测得槲皮素平均回收率为 98.11%，木犀草素平均回收率为 96.83%，RSD分别为 1.94%和 1.86%。2
11、.3.8 样品的测定各样品按“2.3.3”项下方法，制成供试品溶液，注入高效液相色谱仪进行测定，记录槲皮素和木犀草素的峰7面积，计算含量。结果见表 2。表 2 各菊花中槲皮素和木犀草素含量测定结果（略）2.4 总黄酮的含量测定 22.4.1 对照品溶液的制备称取芦丁适量，用 70%乙醇溶解，置 50 ml 量瓶中，制成浓度为 0.226 mg/ml 溶液，备用。2.4.2 供试品溶液的制备精密称取菊花粉末 1 g，置锥形瓶中，加 70%乙醇 30 ml 在 60恒温水浴温萃 30 min，冷却，抽滤，洗涤至 100 ml 量瓶中，用 70%乙醇定容至刻度，摇匀。精密吸取 3 ml 于 10 m
12、l 量瓶中，用 30%乙醇定容，分别精密吸取 2 ml 于 10 ml 试管中，加 5%亚硝酸钠溶液 0.3 ml，振摇均匀放置 6 min，再加 10%硝酸铝，震荡均匀，放置 6 min，再加 4%氢氧化钠 4 ml， ，振荡摇匀，用 30%乙醇定容，放置 10 min 后置比色皿中于510 nm 处测定吸光值。以 30%乙醇为空白溶液。2.4.3 标准曲线的制备精密吸取芦丁对照液0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 ml，分别置 10 ml 量瓶中，加入 5%亚硝酸钠溶液 0.3 ml，振摇均匀放置 6 min，再加 10%硝酸铝 0.3 ml，振荡均匀，放置 6 min，再加 4%
13、氢氧化钠 4 ml，振荡摇匀，用 30%乙醇定容至刻度，振荡摇匀，放置 10 min 后采用分光光度8法，在 510 nm 处测定吸光值，以对照品浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程为 Y=1.079 6X+0.032 8(R=0.991 5),说明芦丁在浓度 0.2261.13 mg/ml 范围内线性关系良好。2.4.4 样品的测定按“2.4.2” 项的方法制成供试品溶液，依法测定。结果见表 3。表 3 各菊花中总黄酮含量测定结果表（略）2.5 SO2 残留量的测定 32.5.1 对照品溶液的制备称取 0.5 g 亚硫酸氢钠，溶于 200 ml 四氯汞钠吸收液中，放置过夜
14、，上清液用定量滤纸过滤后用硫代硫酸钠标准溶液标定其浓度，再用四氯汞钠吸收液稀释成 2 g/ml做标准液。盐酸副玫瑰苯胺溶液；称取 0.1 g 盐酸副玫瑰苯胺于研钵中，加少量水研磨使溶解并稀释至 100 ml。取出 20 ml 于 100 ml 容量瓶中，加浓盐酸 8.0 ml 混匀，待溶液由红变黄后稀释至该度备用。2.5.2 供试品溶液的制备精密称取 3 g 样品于 100 ml 容量瓶中，加 20 ml 四氯汞钠吸收液，放置过夜，加水稀释至刻度，过滤，弃去初滤液，滤液待测。92.5.3 亚硫酸氢钠标准溶液的标定吸取 10 ml 亚硫酸氢钠-四氯汞钠溶液于 250 ml 碘量瓶中，加 100
15、ml 水，准确加入 20 ml 0.05 mol/L 碘溶液，5 ml 冰醋酸，摇匀，置暗处 2 min 后，迅速以 0.1mol/L Na2S2O3 标准溶液滴定至淡黄色，加 0.5 ml 淀粉指示剂呈蓝色，继续滴定至无色。另取 100 ml 碘量瓶，准确加入 20 ml 0.05 mol/L 碘溶液，5 ml 冰醋酸，按同一方法做试剂空白试验。2.5.4 标准曲线的制备 精密吸取 0.2，0.4 ，0.8，1.2，1.6 ml SO2 标准使用液，分别置于 25 ml 具塞比色管中，于标准管中各加入四氯汞钠吸收液至 10 m，12 g/L 氨基磺酸铵溶液 1 m，10.4%甲醛溶液 1 m
16、l，盐酸副玫瑰苯胺溶液 1 ml 混匀。放置20 min，室温下用比色皿以零管调零，于波长 550 nm 处测吸光度，绘制标准曲线。得回归方程为：Y=0.039 5X-0. 0145 6，R=0. 999 6，样品在 0. 43.2 g/ml 范围内有良好的线性关系。2.5.5 样品的测定按“2.5.2” 项的方法制成供试品溶液，依法测定。结果见表 4。表 4 不同干燥方法菊花中 SO2 残留量结果（略）3 讨论10由表 1 可知，硫熏菊花中绿原酸的含量要高于自然干燥的菊花，并且随着硫磺剂量的增多和熏蒸次数的增多，绿原酸含量也依次增高，这与菊花中存在的多酚氧化酶(PPO)有关。PPO 是一类广泛存在于植物体内的能催化多酚类氧化成醌类的含铜质体金属酶，多分布于花、叶片、块茎、根等组织中。绿原酸是由咖啡酸与奎尼酸生成的缩酚酸，由于其分子结构中存在邻苯二酚结构，所以在有氧条件下极易被 PPO 氧化成醌类物质，产生褐变反应 4 。硫磺熏蒸
