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1、1硝酸亚铈对培养的正常细胞的毒性作用及对肿瘤细胞的抑瘤效应作者：张桂英，赵海军，信振江，曲景乐，王宝贵，王昊【摘要 】 目的 探讨硝酸亚铈体外毒性、抑瘤率及其对细胞周期的影响。方法 采用 MTT 法检测硝酸亚铈对正常细胞系 FL、L929体外毒性，对肿瘤细胞系Hela、SGC7901 、B16 、Lewis、K562、H22 的体外抑瘤效应。采用流式细胞仪检测硝酸亚铈对 SGC7901 的细胞周期影响。结果 硝酸亚铈在 0.64mmol/L 以下时对 FL、L929 无任何毒副作用；硝酸亚铈在 0.64mmol/L 以上时对以上 6 种肿瘤细胞均有明显的抑制增殖作用，在 0.08mmol/L
2、时对 HeLa、SGC7901 、B16 及 K562肿瘤细胞表现出显著的抑制增殖作用，在 0.01、0.04mmol/L 时，对 H22 亦有显著抑制作用；0.08mmol/L 硝酸亚铈作用 48h，能显著延长 SGC7901 细胞株的 G0/G1 期，缩短 S 期；1.28mmol/L硝酸亚铈作用 48h，除了能够显著延长 SGC7901 细胞株的G0/G1 期，显著缩短 S 期以外，还能延长 G2/M 期。结论 硝酸亚铈对正常细胞具有低毒性和高度选择性，在体外通过影响细胞周期来抑制多种肿瘤细胞的生长和增殖。 【关键词】 硝酸亚铈；细胞周期；细胞培养2ABSTRACT: Objective
3、 To investigate the cytotoxicity on normal cell lines of cerium nitrate, the inhibitory effect on tumor cell lines and the effect on cell cycle in vitro. Methods The cytotoxicity of cerium nitrate on FL, L929 and inhibition rate on Hela, SGC7901, B16, Lewis, K562, and H22 in vitro were detected with
4、 the method of MTT. The effect of cerium nitrate on cell cycle of SGC7901 was studied by onefluorescence dying method on flow cytometer. Results Cerium nitrate did not show the toxic activities on FL and L929 cell lines when the dose of cerium nitrate was below 0.64mmol/L. When the dose of cerium ni
5、trate was above 0.64mmol/L, it could noticeably inhibit the growth and proliferation of tumor cells (Hela, SGC7901, B16, Lewis, K562, H22) in vitro. 0.08mmol/L cerium nitrate inhibited the growth and proliferation of tumer cells including HeLa, SGC7901, B16 and K562; cerium nitrate had a noticeably
6、inhibitory effect on the growth and proliferation of H22 cell lines in vitro on 0.04mmol/L and 0.01mmol/L. Cerium nitrate affected tumor cell lines for 48h, cerium nitrate could delay G0/G1 and shortened S of cell cycle at the dosage of 0.08mmol/L; at the same time cerium nitrate could delay G0/G1,
7、G2+M and 3shorten S of cell cycle at the dosage of 1.28mmol/L. Conclusion Cerium nitrate has the property of low toxicity and high selectivity on normal cells, but it can inhibit growth and proliferation of many kinds of tumor cell lines by adjusting cell cycle.KEY WORDS: cerium nitrate; cell cycle;
8、 cellular culture铈元素 Cerium 在 1803 年首次被瑞典化学家伯采利乌斯(J.J.Berzelius)和他的老师黑新格尔(W.Hisingerr)在分析瑞典产的Tungsten 矿(“重石”之意)时发现并命名1。尽管铈元素发现很早，真正应用于工农业生产却是在 80 多年以后，直到 20 世纪才开始应用于医学领域。自上世纪 90 年代起，我国学者纪云晶等人发表论文提出稀土元素有潜在的抗肿瘤作用2；之后又有一系列有关铈与肿瘤发病的流行病关系的报道3，使得稀土元素在抗肿瘤方面的开发与利用受到重视。本研究将对稀土元素铈体外毒性、抗肿瘤作用及其机理进行探索，为稀土元素铈的开发利
9、用提供实验依据。1 材料与方法1.1 细胞株4人羊膜细胞(FL)、小鼠纤维母细胞(L929)、人宫颈癌细胞(Hela)、人胃癌细胞 (SGC7901)、小鼠黑色素瘤细胞(B16)、人肺癌细胞(Lewise)、人髓样白血病细胞(K562)、小鼠肝癌腹水型细胞(H22)均由本教研室提供。1.2 主要试剂硝酸亚铈( 天津市德兰精细化工厂) ； IMDM 培养基(GIBCO公司)；小牛血清 (大连生物试剂厂 )；胰蛋白酶(DIFFICO 公司) ；MTT 粉(AMRESCO 公司)；DMSO( 北京益利精细化学品有限公司 )。1.3 方法1.3.1 硝酸亚铈对正常细胞系 FL、L929 细胞的体外毒性
10、效应将 FL、L929 细胞制成悬液，加入含小牛血清(FCS)40mL/L的 IMDM 培养液，并调整细胞浓度至 1105/mL，取 96 孔平底培养板，各孔加入 100L 细胞悬液；设 10 个给药剂量，分别为阴性对照组、0.01、0.02、0.04、0.08、0.16、0.32、0.64、1.28、2.56mmol/L，每个剂量设 3 个复孔，由低到高，每孔加入硝酸亚铈溶液5100L。在 37、50mL/L CO2 条件下孵育 44h，各孔加入 MTT溶液(5mg/mL)10L，继续孵育 4h 终止培养。弃上清液，每孔加入 100L DMSO，震荡 10min，使结晶物充分溶解。选择 57
11、0nm波长，在酶标仪上测定各孔吸光度(A)值，计算体外细胞毒百分率。体外细胞毒百分率=(对照孔 A 值-药物孔 A 值)对照孔 A 值100%1.3.2 硝酸亚铈对 HeLa 细胞、SGC7901 细胞、B16 细胞、Lewis 细胞、K562 细胞、H22 细胞的体外抑瘤效应细胞培养和检测方法与 1.3.1 所述相同，测定各孔 A 值，计算体外抑瘤率。体外抑瘤率=(对照孔 A 值-药物孔 A 值)对照孔 A 值100%1.3.3 硝酸亚铈对 SGC7901 细胞周期的影响SGC7901 细胞常规培养。将处于对数生长的 SGC7901细胞以 5105/mL 的密度接种于 18 个培养瓶中，培养
12、 24h。分别加入 0.00、0.08、1.28mol/L 的硝酸亚铈，继续培养 48h。用胰蛋白酶消化成单细胞悬液，用 PBS 液离心洗涤 2 次，每次 1000r/min离心 5min，调细胞浓度为 1106/mL。取 1mL 细胞悬液，加入等6体积 RNA 酶，37消化 30min，再加入等体积 PI 染液，4染色30min，进行流式细胞仪测样 4。1.3.4 统计学处理采用 SPSS12.0 统计软件，满足方差齐性条件时，多组比较采用 ANOVA 法分析，多重两两比较采用 LSD 法分析；当各组总体方差不满足方差齐性条件时，多组比较采用 Welch 法分析，多重两两比较采用 Dunne
13、ttT3 法分析，P0.05 为差异有统计学意义。2 结 果2.1 MTT 法检测硝酸亚铈对 FL、L929 细胞的体外毒性效应结果 硝酸亚铈在 0.64mmol/L 剂量以下时对 FL 无毒副作用，并有促进细胞生长的作用，在 0.642.56mmol/L 剂量范围内随剂量增大毒性也增强。1.28、2.56mmol/L 与阴性对照组比较有显著性差异(P0.05)；在 0.16mmol/L 剂量以下时对 L929 无毒副作用，并有促进细胞生长的作用，在 0.642.56mmol/L 剂量范围内随剂量增大毒性也增强。2.56mmol/L 与阴性对照组比较有显著性差异(P0.05，表 1)。表 1
14、MTT 法检测硝酸亚铈对 FL、L929 细胞系的体外毒性（略）72.2 MTT 法检测硝酸亚铈对HeLa、SGC7901 、 B16、Lewis、K562、H22 细胞体外抑瘤率的比较硝酸亚铈 9 个剂量组对 B16、K562 和 H22 细胞的抑制率与阴性对照组比较均具有极显著性差异(P0.01)。硝酸亚铈剂量高于 0.64mmol/L 时对 HeLa、SGC7901 和 Lewis 细胞的抑制率与阴性对照组比较均有极显著性差异(P0.01)；而在0.64mmol/L 以下各剂量组也对上述 3 种肿瘤细胞存在不同程度的抑制作用，尤其 0.08mmol/L 剂量组的抑制率与阴性对照组比较均有
15、极显著性差异(P0.01 ，表 2)。表 2 MTT 法检测硝酸亚铈对HeLa、SGC7901 、 B16、Lewis、K562、H22 细胞增殖的抑制作用比较（略）2.3 流式细胞仪检测硝酸亚铈对 SGC7901 细胞周期的影响SGC7901 细胞加药培养 48h，0.08mmol/L 剂量组与阴性对照组比较，G0/G1 期、S 期均具有极显著性差异 (P0.01)；1.28mmol/L 剂量组与阴性对照组比较，G0/G1 期、S 期、G2+M期均具有极显著性差异(P0.01 ，表 3)。表 3 流式细胞仪检测硝酸亚铈对 SGC7901 细胞周期的影响（略）83 讨论近年来，高效低毒的抗癌药
16、物成为新的研究热点。本研究结果表明，硝酸亚铈在 0.64mmol/L 以下对正常的细胞 FL、L929 无明显毒副作用，甚至有促进细胞生长的作用。这与国内有关报道一致5。体外抑瘤实验证实，受试药物剂量在 0.64mmol/L 以上时，对HeLa、SMMC7221 、SGC7901 、B16、Lewis、K562 以及H22 均有显著的抑制肿瘤增殖的作用，且随着硝酸亚铈剂量的增高抑瘤率也不断上升。尤其值得注意的是 0.08mmol/L 的硝酸亚铈对B16、 SGC7901、HeLa 和 K562 肿瘤细胞表现出显著的抑制细胞增殖作用；0.01 和 0.04mmol/L 的硝酸亚铈对 H22 也表现出显著的抑制细胞增殖作用。因此，硝酸亚铈一方面特异地抑制肿瘤细胞增殖，即硝酸亚铈对肿瘤细胞增殖有显著的抑制作用，对正常细胞的增殖无明显的抑制作用6；另一方面硝酸亚铈在微量时的抑瘤作用也是特异的，即当硝酸亚铈
