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1、1白花蛇舌草对膀胱癌 EJ 细胞株的增殖抑制作用及其机制作者：李雨成 王赞滔 龙志新 刘景汉【摘要 】 目的 研究白花蛇舌草的提取物体外抑制膀胱癌 EJ 细胞株增殖的作用及其机制。方法 体外培养膀胱癌 EJ 细胞株，不同浓度的白花蛇舌草提取物作用 1272 h，通过 MTT 法检测细胞生长的抑制作用，采用荧光标记的方法检测端粒酶含量。结果 随着实验组白花蛇舌草提取物浓度的增加和作用时间的延长 EJ 细胞的生长抑制率也逐渐增加，且在一定的剂量范围内呈浓度、时间依赖性。流式细胞仪分析表明，在培养 72 h 后和对照组相比，实验组端粒酶的数目随着药物浓度的增高而明显减少并且呈现浓度依赖性。结论 白花
2、蛇舌草对膀胱癌 EJ 细胞的增殖有显著的抑制作用，且在一定的剂量范围内呈浓度、时间依赖性。端粒酶在药物作用后数量的变化很可能成为白花蛇舌草抑制膀胱癌 EJ 细胞生长的机制。 【关键词】 膀胱癌；端粒酶；白花蛇舌草第一作者：李雨成(1967) ，男，硕士，副教授，副主任医师，主要从事泌尿外科疾病的研究。目前膀胱癌的主要治疗方法是以手术为主并配合术后化疗，常用的局部化疗药物主要为噻替派、丝裂2霉素、阿霉素，局部免疫治疗药物为卡介苗、干扰素。从中药中筛选抗肿瘤药物为目前肿瘤药物治疗的一个热点。白花蛇舌草对许多株肿瘤细胞的增殖抑制作用已有报道1 4 ，但对膀胱癌 EJ 细胞株的作用尚不清楚。1 材料与
3、方法1.1 材料1.1.1 白花蛇舌草的乙醇提取物1，2中药白花蛇舌草为购自本市中医院中药房的生药，取干燥生草 1 kg 完全浸泡在水中 1.5 h,分别煮 1.5、1.0 、0.5 h，水煎后抽滤提取，并收集提取液 3 次，将 3 次提取液合并浓缩，并加入乙酸乙酯脱脂(12)，取水相液加 6 倍乙醇(预冷)。水相液静置 24 h 后抽滤 5 次得深咖啡色粗多糖，并溶于二蒸水，用针式滤器抽滤后加入 10%的 RPMI1640 完全培养基置于 4冰箱待用 。1.1.2 细胞来源人膀胱移行细胞癌 EJ 细胞株(上海午立生物有限公司)。31.1.3 实验试剂RPMI1640 培养基、胎牛血清、胰蛋白
4、酶、荧光标记山羊抗兔 IgG(FITC)(华美生物工程有限公司) ，兔抗人 TERT 单克隆抗体(美国 Santa Cruz 公司，北京中杉生物有限公司代理)，噻唑蓝(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)(均为 Sigma 公司)。1.1.4 主要设备超净工作台( 江苏省无锡市净化技术研究所华达净化设备厂)；倒置显微镜(日本奥林巴斯公司) ，恒温培养箱( 美国 INK 公司) ，台式低温离心机(Sigma 公司)，流式细胞仪( 美国 B.D 公司)，旋转蒸发仪(上海机械制造厂) 。1.2 方法1.2.1 细胞培养人膀胱癌 EJ 细胞株。培养基为 RPMI1640，内含 10%的胎牛血清及 10 万
5、 U/L 的庆大霉素，在 37，5%CO2 孵箱中培养，每 34 d 换液传代维持适当的细胞密度，0.25% 胰蛋白酶消化细胞。41.2.2 实验分组对照组不加白花蛇舌草提取物加一抗和二抗，每天更换RPMI1640 培养液。实验组加白花蛇舌草提取物浓度分别为0.5、1.0、1.2、1.5 g/L。接种细胞 24 h 进入对数生长期后开始加药，每天换液以维持药物浓度恒定。空白组(MTT 法不设空白组)不加白花蛇舌草提取物，加等量的 PBS(pH7.4)代替一抗和二抗。1.2.3 细胞毒性分析用 MTT 比色法测定不同浓度白花蛇舌草提取物对 EJ 细胞增殖的影响并绘制剂量 效应曲线。将细胞数为 2
6、104/ml 呈对数生长期的 EJ 细胞接种于 96 孔培养板中，于 37 含 5%CO2 孵箱中培养 24 h，进入对数生长期后，将细胞分成实验组、对照组，实验组加不同浓度中药制剂，每个浓度设 5 个复孔；对照组加肿瘤细胞不加任何药物，为阴性对照。分别培养 12、 24、48、72 h 后每孔加入 MTT 溶液 20 l,作用 4 h 后弃上清，每孔加入二甲基甲砜 100 l，振荡 10 min，使结晶物充分溶解。在酶标仪 570 nm 波长处读取吸光度 A 值。1.2.4 端粒酶的定量检测3 ，45将对照组、实验组和空白组共同培养 72 h。用 0.25%的胰蛋白酶消化后收集数量不少于 1
7、106/ml 细胞于 1 ml Ep 管中，共30 个。4缓冲液离心洗 2 次( 去上清)。4%多聚甲醛 1 ml 悬起细胞，室温孵育 10 min，4 缓冲液洗 1 次(去上清)。加甲醇 1 ml/1106/ml 悬起细胞，室温孵育 10 min。4缓冲液洗 1 次(去上清)。用 0.2%TristonX100 1 ml 悬起细胞，PBS 洗后 4 离心(去上清) 。对照组、实验组加鼠抗人 hTERT 单克隆抗体(1200) 稀释液 100 l 混匀室温孵育 30 min，4缓冲液洗 1 次(去上清)，空白组加等量的 PBS。对照组、实验组加荧光标记的二抗山羊抗兔IgG(1200)稀释液 1
8、00 l 悬起细胞,室温避光孵育 30 min，用 4缓冲液离心洗 1 次(去上清)。空白组加等量的 PBS。0.1%多聚甲醛250 l 悬起细胞，4冰箱保存，24 h 内上机测试。1.3 统计学处理 数据用 xs 表示，应用单因素方差分析 LSD 检验的方法进行统计学分析。2 结 果2.1 肿瘤细胞生长抑制率6白花蛇舌草提取物作用于膀胱癌 EJ 细胞 72 h 后，细胞增殖受到明显抑制，且抑制效果随着时间和浓度的增加而增强。并且 1.5 g/L 浓度组在作用 48、72 h 达到 IC50，说明白花蛇舌草提取物对EJ 细胞的增殖抑制作用呈时间和剂量依赖性。表 1 各组肿瘤细胞生长抑制率(略
9、)2.2 流式细胞仪检测加药后端粒酶含量MTT 法检测发现白花蛇舌草提取物作用于膀胱癌 EJ 细胞 72 h 各浓度组对肿瘤细胞的增殖抑制作用最强，所以荧光标记法的细胞培养时间为 72 h。对照组端粒酶含量为 42.4653.987，实验组0.5、1、1.2、1.5 g/L 组端粒酶含量分别为33.5801.842、25.7103.222、15.3342.555、9.1181.874。各实验组与对照组及空白组(0.0160.005)比较均有统计学意义(均P 0.001)。3 讨论白花蛇舌草内服用于清热解毒、利湿通淋，对毒蛇咬伤、结肠炎、肠胃溃疡、肝炎、肿瘤、急慢性喉炎有治疗作用，外用治疗疮痈肿
10、毒。现代药理研究表明，白花蛇舌草提取物能激活 T 细胞，使其释放干扰素 ，杀死肿瘤细胞，具有抗突变、抗烟焦油对淋巴细胞7DNA 的损伤和增强人体非特异性免疫功能的作用4 。在临床上广泛应用于各种癌症的治疗，特别是对消化系统的肿瘤效果突出。本实验首先通过 MTT 法证明，白花蛇舌草提取物对 EJ 细胞的生长有明显的抑制作用，而且这种抑制作用随着时间和药物浓度的增加而增强，从实验结果可以看出药物浓度在 0.51.2 g/L 时细胞增殖明显受到抑制，1.5 g/L 时在作用 48、72 h 达到 IC50。采用荧光标记法证明白花蛇舌草提取物抑制 EJ 细胞增殖是通过减少肿瘤细胞内端粒酶的数量实现的，
11、实验方法参照了流式仪荧光原位杂交术5 ，是免疫组化技术与流式细胞术充分结合。首先使已经结合了一抗(兔抗人 hTERT 单克隆抗体 )的肿瘤细胞与二抗( 荧光标记山羊抗兔 IgG)特异性结合进行荧光染色，利用流式细胞仪定量分析检测细胞特异性标记物的功能来检测端粒酶的数量变化。真核细胞染色体末端含有串联重复的 DNA 序列称为端粒。端粒是由 DNA 和相关蛋白质组成的，体细胞分裂时端粒的末端均会随每次的复制被逐渐缩短，当缩短到一定程度不能维持染色体的稳定时细胞最终死亡。端粒酶是由 RNA 和蛋白质组成的核糖核蛋白酶，含有引物特性和识别位点，能以自身 RNA 组分为模版合成DNA 和 TTAGGG
12、重复序列，并加到染色体的末端以补偿细胞分裂时染色体末端的缩短。端粒酶究竟是通过何种机制使癌细胞获得永8生，有人提出“端粒 端粒酶假说” ，即在细胞有丝分裂过程中，随着部分端粒酶序列的丢失，端粒长度缩短，当缩短到一定长度时可能触发染色体端粒旁的某些基因或者由于缩短后端粒产生的某些DNA 损害信号 (可能由抑癌基因 PRb 和 p53 介导)使细胞进入第一致死期 M1。当 PRb 和 p53 发生突变或结合了癌基因蛋白诸如Sv40T 抗原或 E6/E 蛋白时细胞可越过 M1 期继续分裂，端粒继续缩短，最终进入第二致死期 M2。这时染色体可能出现形态异常，某些细胞由于端粒太短而失去功能，导致细胞死亡
13、。端粒长度的调整受端粒延长或缩短两个过程的动态平衡影响而得以维持6 。端粒酶活性增强与恶性肿瘤发生、发展密切相关，肿瘤的恶性程度越高，分化越差或病程越是晚期端粒酶的活性就越高。肿瘤治疗的理想靶点应该是肿瘤生长所必需，而正常细胞又不存在的细胞成分。目前的研究结果表明，端粒酶活性在恶性肿瘤组织的检出率为 85%95%，而在良性肿瘤及正常组织中检出率仅为 4%，端粒酶的活化可能是肿瘤细胞永生化和癌症恶化的重要因素，也就是说大多数恶性肿瘤细胞可能是依靠端粒酶维持不断复制繁殖的，抑制端粒酶活性，减少端粒酶数量就有可能成为肿瘤治疗的新策略，而能够减少端粒酶数量、抑制端粒酶活性的药物也就会成为肿瘤药物治疗研
14、究的一个新的热点7 10 。从荧光标记实验的结果可以看出白花蛇舌草作用 EJ 细胞后端粒酶的数量明显减少且呈浓度依赖性，这不仅解释了在 MTT 实验中白花蛇舌草提取物抑制膀胱癌 EJ9细胞增殖的机制，也为白花蛇舌草可能用于膀胱癌的治疗及中草药的抗肿瘤作用提供了理论依据。【参考文献】1 钱韵旭，赵浩如，高展. 白花蛇舌草提取物的体外抗肿瘤活性J.江苏医药与临床研究，2004;12(4):368.2 赵浩如，李瑞，林以宁. 白花蛇舌草不同工艺对抗肿瘤活性的影响J.中国药科大学学报，2002;33(6)：5103.3 祁嘉义，范伟平，鞠培培 .白花蛇舌草的提纯与纯化J.南京医科大学学报，2001;2
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