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1、1甲状腺乳头状癌基因谱表达的初步研究【摘要】 目的：利用基因芯片筛选与甲状腺乳头状癌发生、发展和与恶性度相关的基因。方法：分别选取高、低分化甲状腺乳头状癌组织标本，抽提、纯化 mRNA，同法再纯化同患者的正常甲状腺组织的 mRNA；用 Cy5 荧光染料对甲状腺乳头状癌组织 mRNA作探针标记，以 Cy3 荧光染料对正常黏膜组织的 mRNA 作探针标记，一同和可检测 4 096 个基因片段的 BiostarH40 s 型基因芯片进行杂交得到的双色荧光标记芯片，将之分别扫描入计算机，进行结果分析。结果：高、低分化 2 种芯片上均有大量基因片段出现了的高/低表达的情况，高分化芯片上异常表达片段数量为
2、低表达 351条，高表达 417 条，低分化芯片上异常表达者为低表达 410 条，高表达 415 条。在 2 种芯片中均有相同表达差异趋势的基因片段中，共计有 90 条基因片段出现低表达，其中随恶性度增高而降低的基因有 19 条；有 78 条片段呈现高表达状态，其中随恶性度增高而表达增加的有 25 条。表达异常的片段功能较分散；有大量的不明功能的片段发现。结论：甲状腺乳头状癌的发生、发展不能用单一的基因变异解释，而是由多基因共同作用的结果，并且变异具有明显的个体性差异；甲状腺乳头状癌的恶性度与多个基因片段异常表达相关。很多新发现的片段的功能不明了，对于确定甲状腺乳头状癌的发生发展内在机制仍有待
3、研究。 2【关键词】 基因芯片；基因表达；甲状腺癌ABSTRACTObjective: To screen genes that were correlative with carcinogenesis, development and malignance of papillary thyroid carcinoma using cDNA microarray. Method: Two pieces of papillary thyroid carcinoma tissue with different malignance degree and samples from normal th
4、yroid tissue were collected for mRNA extraction and purification. Marked the purified mRNA from carcinoma tissue with Cy5 deoxycytidine triphosphate for probes labeling and mRNA from normal tissue with Cy3dCTP separately, mix these two kinds of mRNA probes together and then hybridize to the cDNA mic
5、roarray. If Cy3 signal is stronger, the spot on the microarray would be green, means lowexpressed gene. While stronger Cy5 signal will lead to a red spot, which means overexpressed gene. Experiment gets 2 pieces of doublecolor cDNA microarrays and then they were scanned into computer and analyzed. R
6、esult: Differences were found between carcinoma tissue and normal thyoid tissue in their gene fragments expression. In the welldifferentiated chip, there are 351 lowexpressed and 417 overexpressed gene fragments presented. To the poorly 3differentiated chip, the correspondence number was 410 and 415
7、. 90 lowexpressed and 78 overexpressed genes fragments were individually presented in both chip segments with similar expression trend, of which, expression of 25 seemed correlated to malignant degree. Large quantity of genes with unknown functions were found. Conclusion: The carcinogenesis, develop
8、ment and malignance degree of papillary thyroid carcinoma is resulted from different kinds of abnormality of polygenes not a single gene. Since functions of many gene fragments has been unknown to us yet, further study still needs to be done. KEY WORDS Gene chip; Gene expression; Thyroid carcinoma甲状
9、腺癌是头颈部最常见的恶性肿瘤，病理分型上分为 4 种：乳头状癌、滤泡型癌、髓样癌、未分化癌，其中又以乳头状癌(papillary thyroid carcinoma， PTC)所占比例最大，约为 70%左右，故而获得了更多的研究关注。在以往的文献中，对于乳头状癌异常基因片段表达情况的研究多为某一片段，难于产生较为全面的认识。本实验即利用基因芯片对甲状腺乳头状癌的基因进行大规模片段的研究，对其基因谱表达作一初步分析。41 材料与方法1.1 材料1.1.1 标本制备所有病例均来自哈尔滨医科大学附属肿瘤医院。术前选择单侧甲状腺发生肿瘤病例，手术中切取肿瘤组织和对侧腺体正常组织，分别进行液氮冷冻保存。
10、术后根据病理诊断，确定为单侧甲状腺乳头状癌者标本留用，否则筛除。最终样本皆为女性。1.1.2 基因芯片上海博星公司产 BiostarH40 s 基因芯片。1.1.3 实验试剂均由上海博星公司对外试验室提供，包括 TRIzol，异丙醇,氯仿，RNeasy Midi kit 75142，Easy Exteact，75%乙醇(RNasefree)，MilliQ 水(RNasefree) ，无水乙醇,杂交试剂盒等。其中 TRIzol 购自 LifeTechnologies 公司，试剂盒中5RNAlater，DEPC，RNAsecure TM Reagent 购自 Qiagen 公司。1.1.4 仪器与
11、设备S200 纯化柱购自 Amersham Pharmacia Biotech Inc，CT0250 型真空浓缩仪购自 CHRIST Ltd.，GenePix 4 000B型芯片扫描仪购自 AXON Ltd，核酸分析仪产自 Biochrom Ltd. Cambridge CB4 OFJ England，MilliQ 水生成仪购自 MILIPORE Ltd.， DY891 型电动玻璃匀浆机产自宁波新芝科器研究所，FR280 型电泳仪和 FR200 型凝胶成像仪产自上海复日科技，QL901 型漩涡混合器购自海门市麒麟医用仪器厂，DND9052 型杂交箱产自上海精宏实验设备有限公司。1.1.5 计算
12、机处理软件采用 GenePix Pro 3.0 计算机处理软件1.2 方法1.2.1 组织标本的获取手术中甲状腺肿瘤标本切下后，立即切取肿瘤组织和对侧腺6体组织标本，分别置入冷冻管中，标明实验组和对照组编号，迅速投入液氮容器冷却，整个过程在 3 min 内完成。术后对肿瘤组织和对侧腺体组织作病理以明确病理性质。留用标准为：单侧乳头状癌，对侧组织为正常腺体、组织切片内未见微转移灶或其他良性病变。1.2.2 分组按照分化程度，将高分化、低分化乳头状癌分别进行试验。1.2.3 总 RNA 提取将超低温保存的样品称重、碾磨、匀浆、多次离心得到 RNA 沉淀后，加入 RNasefree 的 MilliQ
13、 水溶解，保存。1.2.4 探针标记与杂交预杂交、在冰浴中进行探针标记(对癌组织用 Cy5 荧光染料作标记，作对照的同患者的对侧正常甲状腺组织则以 Cy3 荧光染料作标记)、杂交、洗片, 芯片晾干后扫描入计算机。1.2.5 计算机处理将扫描结果进行计算机处理，测定基因变化情况。72 结果2.1 总 RNA 检验结果两组样本的 mRNA 质量及数量经检测全部合格，符合实验要求。2.2 基因芯片的原始情况基因芯片的荧光标记图像(图 1)叠加，扫描入计算机后，进行分析处理。基因片段表达高低的判定方法为：以 Y 轴表示 Cy5 荧光的杂交信号相对强度,X 轴示 Cy3 的杂交信号强度，作图(图 2)，
14、每一个数据点代表芯片上 1 个基因点的杂交信号。结果可见大部分基因信号位于 45 度线附近，Cy5/Cy3 的比值在 0.52.0 之间，在此范围基本属于非差异性表达；远离 45 度角直线的点 (Cy5/Cy3 的比值在 0.52.0 范围之外) 则提示基因片段存在差异性表达，低于0.5 者为低表达，高于 2.0 为高表达。2.3 表达差异基因分类结果高、低分化两种芯片上均有大量基因片段出现了的高/低表达的8情况，高分化芯片上异常表达片段数量为低表达 351 条，高表达417 条，低分化芯片上异常表达者为低表达 410 条，高表达 415 条。在 2 种芯片中均有相同表达差异趋势的基因片段中，
15、共计有 90 条基因片段出现低表达，占基因检测总数的 2.20%，其中随恶性度增高而降低的基因有 19 条；有 78 条片段呈现高表达状态，占总数的1.90%，其中随恶性度增高而表达增加的有 25 条。表 1 中列出了2 张芯片中 Cy5/Cy3 值超过 8 的片段。表 1 低、高分化甲状腺乳头状癌最高表达基因片段对照简表（略）3 讨论甲状腺癌是头颈部最常见的恶性肿瘤之一，甲状腺恶性肿瘤中 PTC 最常见。国际上公认 PTC 的病理诊断标准为细胞核呈毛玻璃样伴有核沟及核内包涵体1 。但恶性肿瘤具有异质性，有些PTC 并不具有上述特征，一些良性甲状腺病变也有类毛玻璃样核。在活检及细针吸取甲状腺标
16、本中，一些 PTC 单凭 HE 染色，镜下难以与良性病变区别，易造成误诊和漏诊，延误病情，临床实际工作中需要新的可靠的标记物协助 PTC 诊断鉴别。明确甲状腺乳头状癌的基因谱变化对明确甲状腺乳头状癌的分子生物学发生、临床快速诊断以及将来的个性化基因治疗都有意义。基因芯片杂交技术是近几年新发展的具有突破性的基因水平9检测技术，实验方法简便，结果准确，具有高通量、高特异性的特点2 ，可以同时检测几千乃至上万基因片段的表达情况，最适合于肿瘤基因的大规模分析3 。本次实验所用基因芯片为包含有 16类共 4 096 个基因探针，可检测的基因片段有原癌基因和抑癌基因、离子通道和运输蛋白、细胞周期蛋白类、外压反应蛋白、细胞骨架和运动、细胞凋亡相关的蛋白等 15 类已知的及若干功能尚未明了的未知片段。在 2 种芯片中，各自有约 20%左右的片段发生异常表达，由此可见，发生变异的甲状腺癌基因片段是多量存在的，并非只是个别片段。比照差异片段，只有总
