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1、1生后早期大鼠视皮层锥体神经元的电学特性作者：孟凯，李延海，谢雯，张莉，李萍，韩太真【摘要 】 目的 观察生后早期大鼠视皮层/层锥体神经元的电学特性。方法 采用膜片钳全细胞记录结合显微镜直视细胞技术，在急性分离的大鼠视皮层脑片标本上，探讨生后早期大鼠视皮层/层锥体神经元的被动和主动电学特性以及动作电位(AP)的发放特征。结果 生后 1113d(P 1113) 大鼠锥体神经元静息电位为 (-56.61.8)mV，输入阻抗为(185.42.7)M，膜电容为(77.92.2)pF，时间常数为(16.92.4)ms 。AP 的幅值和时程分别为(97.72.7)mV 和(2.30.1)ms，阈电位为(-
2、31.81.4)mV，后超极化电位为(-65.31.3)mV。在受到长的强度不变的去极化电流时，多数神经元表现出明显的锋电位频率适应。AP 发放时其稳定放电频率约为第 1个放电频率的(30.49.4)% 。结论 P 1113 大鼠视皮层的锥体神经元的电学特性与成年大鼠不完全相同，大多数的神经元表现出规则放电形式，但其放电频率的适应程度较小。 【关键词】 电学特性;大鼠;视皮层; 膜片钳ABSTRACT: Objective To investigate the electrophysiological properties of layer / pyramidal 2neurons of th
3、e early postnatal stage rat visual cortex.Methods By using the whole cell patchclamp recording technique combined with direct visualization of cells, we studied the passive and active electrophysiological properties as well as firing properties of layer / pyramidal neurons in acute rat visual cortic
4、al slices.Results Resting membrane potential, input resistance, membrane capacitance and membrane time constant of pyramidal neurons at postnatal days 11-13 (P 11-13) were (-56.61.8)mV, (185.42.7)M, (77.92.2)pF and (16.92.4)ms, respectively. Action potential amplitude and duration were (97.72.7)mV a
5、nd (2.30.1)ms, respectively. Threshold potential was (-31.81.2)mV and afterdepolarizing potential was (-65.31.1)mV. When presented with long depolarizing current pulse of constant amplitude, most of the neurons exhibited pronounced adaptation of spike frequency. The steadystate firing frequency was
6、(30.49.4)% of the first interval firing frequency.Conclusion The electrophysiological properties of layer / pyramidal neurons of the early postnatal stage rat visual cortex are not fully mature. Most of the neurons display regular firing patterns, but the degree of firing frequency adaptation is rel
7、atively small.3KEY WORDS: electrophysiological properties; rat; visual cortex; patch clamp锥体神经元是皮层的投射神经元，它发出的轴突投射皮层及皮层下区域，具有远距离传送信息的功能;而非锥体神经元主要在皮层内形成局部回路。了解新皮层神经元的电学特性是认识神经元在神经网络中的作用和功能的关键要素1。神经元的电学特性，不仅显著影响神经元的输入 输出关系(inputoutput relationships)及神经元和神经回路的活动2，而且可作为判定神经元种类的标准。不同脑区皮层锥体神经元的电学特性不完全相同，一般
8、而言，在受到较长时间的刺激时，其动作电位(action potential, AP)的发放有适应性，即为规则放电(regular spiking)，但不同的神经元其频率的适应程度、AP 的特性、后超极化电位(afterdepolarizing potential, AHP)的大小及持续时间等则有较大的差异3 。此外，神经元的内在膜特性还能反映出神经元的成熟状态，因而它们又可作为评估神经元成熟程度的重要指标之一4。资料显示，生后前 10d内神经元电学特性变化最大，在生后的前两周内，神经元电学特性随发育变化很快，到第 3 周末接近成年时的水平 58。之前有关视皮层/层锥体神经元电生理特性的研究资料
9、，主要是采用常规细胞内记录方法获得的，如 1990 年 MASON 等9采用此方法探讨了成年大鼠视皮层/层锥体神经元的电学特性，至今仍作为重要的参考资料。本研究中，我们采用膜片钳全细胞记录技术，在急性分4离的大鼠视皮层脑片标本上，系统探讨了生后早期大鼠视皮层/层锥体神经元的被动和主动电学特性，以及 AP 的发放特征。研究结果进一步丰富了锥体神经元的电生理学资料，为充分了解神经元功能及探讨该部位的突触可塑性提供背景性资料。1 材料与方法1.1 实验动物 实验选用西安交通大学医学院实验动物中心提供的健康 SpragueDawley 大鼠，鼠龄为生后1113d(postnatal day 1113,
10、 P 1113)(大鼠出生日为 P0)。动物在 12/12h 明/ 暗交替的环境中饲养。1.2 视皮层脑片的制备与孵育 采用常规方法制备视皮层脑片标本10。大鼠用乙醚麻醉后，浸没在冰水中(暴露鼻孔)3min ，以降低脑温度，待仅有微弱呼吸时取出。大鼠断头后，立即将大脑移出并放置于冰冷(14)的 950mL/L O2 和50mL/L CO2 饱和的人工脑脊液(artificial cerebrospinal fluid, ACSF)中。ACSF 中含(单位 mmol/L)：NaCl 124，KCl 5，KH2PO4 1.25，MgSO4 1.3，CaCl2 2.4，NaHCO3 26，葡萄糖 1
11、0，其渗透压为 305310mOsm/kg H2O。用振动5切片机(MA752 ，英国 Campden 公司)将含有视皮层的脑组织块切成 400m 厚的脑片。将切好的脑片移至内有 ACSF 的自制的孵育槽内，并持续通 950mL/L O2 和 50mL/L CO2 的混合气体，室温下孵育。在电生理实验前，脑片孵育至少 1.5h。1.3 视皮层脑片的全细胞记录 将孵育后的脑片转移到灌流记录槽中，并放置自制的铂金盖网(用铂金丝弯成 U 形框架，在其上粘附几根细尼龙丝)于脑片上方以固定脑片的位置。使用蠕动泵持续向记录槽中灌注氧饱和的 ACSF，灌流速度为 2.53mL/min，使用温控仪将记录槽内灌
12、流液温度维持于(310.5)。使用奥林巴斯直立式红外微分干涉相差显微镜，确定脑区和选择细胞。首先，参照脑立体定位图谱11，在低倍物镜(5)下找到大鼠初级视皮层单眼区(primary visual cortex, monocular area, V1M)的/层(图 1)，然后在高倍浸水物镜(40)下，通过红外摄像头在监视器上选择边界清楚、表明光滑且折光性强的锥体细胞，并在监视器屏幕上标记定位此细胞。使用微电极拉制仪(P97，美国 Sutter 公司)拉制玻璃微电极作为记录电极，灌充电极内液后其电极阻抗为 35M。电极内液中含(单位 mmol/L)：Kgluconate 135，KCl 5，MgC
13、l2 2，CaCl2 0.1，EGTA 1，HEPES 10，Na2ATP 2，Na3GTP 0.25，其渗透压为6280 290mOsm/kg H2O，用 KOH 将其 pH 调于 7.37.4 。将记录电极安置在微电极操纵仪的电机架上，在低倍物镜下调整微电极的位置。给予电极内一定的正压后将其浸入 ACSF，下移微电极直至视皮层脑片上方后，转换低倍物镜为高倍物镜，补偿电极直流电位，继续下压电极至目的细胞上方，待细胞表面出现一小凹，立即撤除正压并给予短暂的负压，借助钳制电位水平(-70mV)可获得高阻抗(1G)封接。成功封接后补偿电极电容，施加负压或 /和ZAP 电脉冲，穿破微电极尖端内的细胞
14、膜，使细胞内液与电极内液相通，建立全细胞记录模式。采用电压钳、电流钳记录模式，利用Axoclamp 700B 放大器分别将细胞的膜电位或膜电流钳制在设定水平上，模数-数模转换器(Digidata 1322A)采样频率为 10kHz，低通滤波频率为 2kHz，未补偿串联阻抗。数据的采集和分析均使用Axon 公司提供的软件包 pCLAMP 9.2。用于分析的实验数据标准为串联阻抗小于 20M，其变化不大于 10%。1.4 神经元电学特性的观测 神经元电学特性是在全细胞记录模式稳定至少 3min 后测量。在电压钳模式下，将细胞的膜电位钳制在-70mV，同时给予细胞去极化步进电压指令，使用 Clamp
15、ex 9.2软件中的膜测试功能(membrane test)，可以直接测出细胞膜的部分被动电学特性，包括输入阻抗(input resistance, Rin)和膜电容(membrane capacitance, Cm)12。在电流钳模式下，将钳制电流设置为 0pA，此时的膜电位即为静息电位(resting potential, RP)，7在此模式下继续观测神经元膜的电学特性。在由注入持续时间为1000ms、幅值为 40pA 的超极化电流诱导的电压反应中测量膜时间常数(membrane time constant, )13。为了研究 AP 的特性，注入持续时间为 4ms 的去极化步进电流以诱导产
16、生单个动作电位，参照文献1314 观测阈电位(threshold potential, TP)、AP 的幅值和时程、AHP 等。给神经元注入持续时间为1000ms 的去极化步进电流，探讨神经元的放电特征。神经元的瞬间放电频率(instantaneous firing frequency)为串动作电位中相邻锋电位时间间隔的倒数，AP 放电频率适应 (firing frequency adaptation)的程度用稳定放电频率占第 1 个放电频率的百分比来衡量14。1.5 数据分析 所有分析的神经元需满足以下条件：RP 的绝对值大于 50mV;AP 的阈电位值比 RP 值低 10mV 以上;AP的超射值在 0mV 以上 9。使用 pCLAMP 9.2 软件包中的 Clampfit 9.2 分析和处理符合要求的数
