《猪流感病毒H1亚型HA蛋白特异性单克隆抗体的研制》由会员分享，可在线阅读，更多相关《猪流感病毒H1亚型HA蛋白特异性单克隆抗体的研制（12页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1猪流感病毒 H1 亚型 HA 蛋白特异性单克隆抗体的研制作者：李洪涛, 刘明, 刘春国, 杜金玲【摘要 】 目的: 研制猪流感病毒抗 H1 亚型 HA 特异性单克隆抗体(mAb)。方法: 构建 H1 亚型猪流感病毒A/Swine/Guangdong/LM/2004(H1N1)HA 基因表达质粒, 基因免疫 68 周龄雌性 BALB/c 小鼠, 加强免疫后取其脾细胞与骨髓瘤细胞 Sp2/0 进行融合。通过 ELISA、 HI 试验筛选阳性克隆。应用ELISA、HI 试验和 Western blot 试验测定 mAb 的反应性和特异性。结果: 共获得 3 株分泌抗 H1 亚型猪流感病毒 HA 蛋
2、白的杂交瘤细胞株, 分别命名为 8C4、8C6、9D6。mAb 腹水 ELISA 效价在116 0001256 000 之间; HI 效价为 1512 1256 000; 对 A/Swine/Guangdong/LM/2004 的中和效价分别为 : 10-2.83、 10-6.4、10-5.8。Western blot 分析结果显示, 3 株 mAb 只与 H1亚型猪流感病毒 HA 蛋白反应。结论: HA 蛋白特异性 mAb 的研制为 H1 抗原变异分析及 H1 亚型猪流感诊断方法的建立奠定了物质基础。 【关键词】 猪流感; 基因免疫; 单克隆抗体; 血凝抑制2Abstract AIM: To
3、 prepare the monoclonal antibodies(mAb) against the HA protein of subtype H1 of swine influenza virus (SIV). METHODS: To construct recombinant expression plasmid subtype H1 of SIV HA gene of A/Swine/Guangdong/LM/2004(H1N1).BALB/c mice of 6-8 weeks old were immunized endemically with the recombinant
4、plasmid.The splenocytes from the immunized mice were fused with Sp2/0 myeloma cells after the last immunization. Hybridoma cells were screened by ELISA and hemagglutination inhibition (HI) tests.The activity and specificity of mAbs were evaluated by HI test and Western blot assay. RESULTS: Three hyb
5、ridoma cell lines secreting specific mAbs named 8C4, 8C6, and 9D6 were developed. The ELISA titer of these mAbs was 116 000-1256 000, the HI titer was 1512-1256 000; The neutralized titer of 8C4, 8C6, and 9D6 to A/Swine/Guangdong/LM/2004(H1N1) was 10-2.83, 10-6.4 and 10-5.8. Western blot analys conf
6、irmed that mAbs only reacted with HA protein of subtype H1 of SIV. CONCLUSION: These mAbs can be used as a useful tool to analyze the antigenic variation.They also provide the effective reagents for the rapid detection of subtype H1 of SIV.3Keywordsswine influenza; gene immunization; monoclonal anti
7、body; hemagglutinin猪流感是规模化养猪场普遍存在且难以根除的猪群发性疾病, 不仅可直接引起患猪死亡, 而且使猪群生产性能下降, 对养猪业危害极大。更值得重视的是, 猪流感病毒（swine influenza virus, SIV）是 “猪呼吸道病综合症”的原发性致病原, 并且猪是人源、 禽源和猪源流感病毒的惟一共同易感宿主, 因此 SIV 也具有重要的公共卫生学意义1 。在 SIV 的检测方法中, 血凝抑制试验(HI) 和荧光抗体技术(FA)是最为快速和简便的血清学检测技术。单克隆抗体（mAb）以其特异性高、 敏感性强被广泛用于各类疾病病原的血清学检测和诊断中2 。在动物体内
8、由于免疫力的作用 , 流感病毒表面血凝素基因(hemagglutinin, HA) 非常容易发生抗原漂移3, 常导致待测病毒与标准检测抗体的交叉反应性差, 给检测工作带来许多困难。因此, 研制针对 SIV HA 蛋白 mAb, 对快速准确地检测 SIV 具有重要的应用价值 4 。另外 HA 蛋白因其具有良好的免疫原性使其成为基因工程疫苗的首选5 。1 材料和方法1.1 材料4A/Swine/Guangdong/LM/2004(H1N1)毒株由本实验室分离鉴定, 小鼠骨髓瘤细胞 Sp2/0 由本实验室保存。鸡胚、 BALB/c小鼠(8 周龄, 雌性)均购自哈尔滨兽医研究所实验动物中心。鉴定所用毒
9、株均为本实验室保存。辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠二抗购自中杉金桥公司; 聚乙二醇(PEG)购自 Sigma 公司; mAb 亚型鉴定试剂盒购自 Southern Biotech 公司 ; 次黄嘌呤 氨基蝶呤 胸苷培养基（HAT） 、 次黄嘌呤 胸苷培养基(HT)购自 Gibco 公司; 细胞培养用牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司; 其他普通生化试剂均为国产分析纯。1.2 方法1.2.1 引物设计与合成参照 GenBank 上已发表的 H1 亚型 SIV HA 基因序列设计引物, 序列: P1: 5CGCGCTAGCATGAAGGCAATACTAGTGTTC3, P2: 5CGC
10、TCGAGTTAGATCGCCAAAATTTGGTAAAT3由上海博亚生物技术有限公司合成, 预计目的片段长度 1 700 bp。1.2.2 H1 HA 基因 PCR 扩增5按常规 PCR 方法扩增 , 程序为: 94 4 min, 94 30 s, 54 30 s, 72 2 min, 30 个循环后, 72 10 min。扩增产物 10 g/L 琼脂糖凝胶电泳鉴定。1.2.3 重组质粒的构建PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳回收纯化后与 pCIneo 质粒分别用 Nhe/Xho双酶切, 酶切产物电泳回收纯化、 连接后、 转化 DH5 感受态细胞, 37摇床培养 1 h, 涂 Amp 平板, 37
11、 温箱过夜培养, 挑单个菌落接种于 LB 液体培养基, PCR 鉴定。扩大培养阳性菌, 用质粒抽提试剂盒抽提重组质粒, 用 Nhe/Xho双酶切鉴定。1.2.4 抗原制备及免疫按文献6所述的方法制备抗原。根据文献7免疫方法稍作改进, 以 25 g/只肌肉免疫 6 周龄小鼠 , 每隔 2 周免疫 1 次, 共免疫 3 次。融合前 3 d 全病毒加强免疫 1 次。1.2.5 间接 ELISA 方法的建立采用方阵法确定抗原最佳包被浓度、 二抗最佳工作浓度、 6抗原包被条件、 封闭液、 封闭时间、 被检血清最佳稀释度、 待检血清反应时间、 酶标二抗反应时间、 底物反应时间, 间接 ELISA 方法阴性
12、值和阳性值临界值的确定。1.2.6 细胞融合及筛选饲养层细胞、免疫脾细胞的制备以及细胞融合按参考文献8进行。当杂交瘤细胞生长至 1/31/2 孔底面积时, 吸取上清液, 采用已建立的间接 ELISA 方法检测, 对检测为阳性孔的细胞扩大培养并冻存, 同时按有限稀释法亚克隆, 经过至少 3 次克隆, 待检测全部孔为阳性时, 确定建立 mAb 细胞株。1.2.7 小鼠 mAb 腹水的制备10 周龄 BALB/c 小鼠腹腔注射 0.5 mL 液体石蜡。1 周后, 每只小鼠再腹腔注射杂交瘤细胞悬液 0.5 mL (约 106 个细胞) 。710 d 后, 无菌采集腹水, 离心, 间接 ELISA、 H
13、I 检测后分装, 置-20 冻存备用。1.2.8 mAb 生物学特性的测定抗体类和亚类的鉴定: 按照 Southern biotech 公司 mAb亚型鉴定试剂盒说明书进行。抗体效价的测定: 间接 ELISA 检测、血凝抑制试验按文献6操作进行。mAb 分泌稳定性测定: 杂7交瘤细胞连续传代 3 个月液氮冻存后复苏, 取培养上清检测 ELISA及 HI 效价。mAb 特异性鉴定: 取杂交瘤细胞培养上清, 分别检测其与 H3 亚型 SIV 分离株、 H5 亚型 AIV 标准株、 新城疫病毒、鹅腺病毒和鸡产蛋下降综合征病毒有无交叉反应。mAb 中和活性的测定: 对 SIV (H1N1)中和活性的测
14、定按照文献6 中固定病毒 稀释血清法（ 法）进行。以 MDCK 细胞为载体, 分别测定半数细胞培养物感染量(TCID50) 以及半数保护量（ PD50）, 结果以ReedMuench 法计算。SDSPAGE 和 Western blot 试验: 试验操作按文献8进行。2 结果2.1 HA 基因 PCR 扩增及重组质粒的构建、鉴定经 PCR 扩增出目的片段 , 大小 1 700 bp, 重组质粒经酶切鉴定后得到 1 700 bp 和 5 400 bp 两个目的片段 , 说明质粒构建成功(图 1、 2)。2.2 ELISA 检测方法的建立抗原包被浓度为纯化病毒作 250 倍稀释, 酶标二抗最佳工作
15、浓度为 2000 倍稀释 , 阳性血清稀释浓度为 1 000 倍稀释, 阴性对8照以 Sp2/0 上清作为对照 , 抗原包被条件为 37 感作 2 h , 封闭液为 500 g/L 脱脂乳 , 37封闭 2h, 杂交瘤细胞上清 37 感作1.5h, 酶标二抗 37 感作 1h, 洗涤过程均是洗涤 3 次, 每次5min, 以邻苯二胺（OPD ）底物显色, 3710 min, 2 mol/L 硫酸终止反应, 用酶标仪 490 nm 读取 A 值, 阴性血清 A 值0.2 , P/N2.1 判为阳性。2.3 杂交瘤细胞株的建立以 HI 和间接 ELISA 法同时筛选, 获得了 3 株(8C4、 8
16、C6、 9D6)抗 H1 亚型 SIV 的 mAb 杂交瘤细胞株, 经 3 个月稳定传代后仍能稳定分泌抗体; 冻存于液氮中, 3 个月后复苏, 细胞生长良好, 抗体分泌水平未见明显改变。2.4 mAb HI、ELISA 效价测定与 mAb 亚类鉴定结果3 株杂交瘤细胞上清、腹水 HI 效价最高分别为 256、256 000 最低分别为 8、512; ELISA 效价最高分别为 256、256 000 最低分别为 64、16 000; 亚类鉴定均为 IgG2a(表 1)。表 1 HI、 ELISA 检测结果及亚类鉴定结果（略）2.5 mAb 特异性反应结果9HI 试验结果表明, 3 株 mAb 株与 H3 亚型 SIV、 H5 亚型AIV、 H9 亚型 AIV 分离株反应均呈阴性; 仅与人A
