《独特型TCR Vα1pIRESTCR Vβ8表达载体构建及体外表达》由会员分享，可在线阅读，更多相关《独特型TCR Vα1pIRESTCR Vβ8表达载体构建及体外表达（16页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1独特型 TCR V1pIRESTCR V8 表达载体构建及体外表达作者：李闯, 吴秀丽, 李扬秋, 周羽竝, 陈少华 , 杨力建, 朱康儿【摘要 】 目的: 构建 Jurkat 细胞株独特型 TCR V1pIRESTCR V8 表达载体, 转染后了解其体外表达情况。方法: 根据聚合酶链反应 基因扫描（PCRGenescan ）检测 Jurkat细胞株 TCR V 及 V 亚家族表达情况, 分别将其所表达的单克隆性的 TCR V1 及 TCR V8 亚家族基因片段克隆至质粒 pIRES 的多克隆位点 A（MCS A)和多克隆位点 B（MCS B)中。通过限制性酶切分析、 序列分析、 RTPCR
2、、 间接免疫荧光、 流式细胞术(FCM) 手段鉴定重组表达载体的正确性以及转染 A549 和 Molt4 细胞后基因及蛋白的表达情况。结果: 构建了 2 组 TCR V1pIRESTCR V8表达载体, 该表达载体转染 A549 和 Molt4 细胞后, 在 mRNA 和蛋白水平检测到了 TCR V1 和 TCR V8 的表达。结论: 成功构建了2 种独特型 V1pIRESTCR V8 真核表达载体, 为利用特异性TCR 基因修饰 T 细胞的研究提供方法学依据。 【关键词】 Jurkat 细胞株 T 细胞受体 转基因Abstract AIM: To construct the eukaryot
3、ic vectors 2with idiotype TCR V1pIRESTCR V8 of Jurkat cell line and investigate their expression in vitro after transferred into eukaryotic cells. METHODS: TCR V and V subfamilies of Jurkat cells were analyzed by using RTPCR and genescan technique. Then the monoclonal TCR V1 and V8 genes of Jurkat c
4、ells were cloned into multiple clone site (MCS) A and MCS B of the eukaryotic vector pIRES respectively. Its sequences were identified by restriction enzyme cutting and sequence analysis. The expression of TCR mRNA and idiotypic protein in transferred A549 and Molt4 cells was tested by RTPCR, indire
5、ct immunophenotyping fluorescein dyeing and flow cytometry, respectively. RESULTS: Two recombinavot eukaryotic vectors with idiotype TCR V1pIRESTCR V8 were developed successfully and the expression of both idiotypic TCR mRNA and protein was detected in transferred A549 and Molt4 cells. CONCLUSION: T
6、he successful construction of the two eukaryotic vectors with idiotype TCR V1pIRESTCR V8 will provide a basic method for furthor study of the specific TCR gene modified T cells.KeywordsJurkat cell line; TCR; gene transfer3利用 RTPCR 和基因扫描分析 T 细胞受体（TCR）的互补决定区 3（complementary determining region 3, CDR3）
7、已经是常规应用于了解 T 细胞所表达的亚家族和克隆性的技术1。近期研究显示将抗原特异的 TCR 基因转导和修饰正常 T 细胞后, 可以诱导出大量表达具有目的 TCR 基因的 T 细胞, 从而应用于特异性免疫治疗等2, 3。该研究的基本条件是构建特异性 TCRVTCRV 双基因表达载体, 并证明其可以在真核细胞中表达。我们首先利用Jurkat 细胞株独特型 TCR 基因构建 TCR V1pIRESTCR V8 表达载体, 并将重组质粒转染至 A549 和 Molt4 细胞中, 检测其在真核细胞中 mRNA 和蛋白水平的表达情况 , 建立了相应的技术, 为进一步研究抗原特异 TCR 基因表达载体的
8、构建和应用提供了实验方法。1 材料和方法1.1 材料 Jurkat 细胞株、 pIRES 质粒由本室保存; TRIzol和逆转录酶 SurperScript II 试剂盒购自 Gibco 公司; 内切酶 Nhe I、 EcoR I、 Xba I、 Sal I 购自 MBI 公司; PurelinkTM Quick Plasmid Miniprep Kit 和 LipofectamineTM2000 购自 Invitrogen公司; E.Z.N.ATM.Kit 胶纯化回收试剂盒购自 OMEGA 公司; T4 DNA 连接酶购自 TaKaRa 公司; 胰酶购自 Sigma 公司; TCR V8 单
9、克隆抗体（mAb）购自 Serotec 公司; Real Mastr Mix 和感受态大4肠杆菌 DH5 购自北京天为时代公司; 倒置相差荧光显微镜为Olympus 产品 ; 流式细胞仪为 BD 公司产品; 普通 PCR 扩增仪为BioMetra 产品; 荧光定量 PCR 仪为 BIORAD 产品; 测序和构建引物合成均在上海英骏生物技术有限公司进行。1.2 方法1.2.1 RTPCR 基因扫描 应用 TRIzol 试剂盒按常规方法提取Jurkat 细胞株总 RNA, 应用随机引物法和逆转录酶 SurperScript II合成 cDNA, PCR 扩增管家基因 2M 检测 cDNA 合成质量
10、。利用TCR V 亚家族（29 个）及 TCR V 亚家族（24 个）序列特异性引物对 Jurkat 细胞株 TCR 的 CDR3 区进行 RTPCR 基因扫描（Genescan）, 结果显示其 TCR V1 亚家族及 TCR V8 亚家族呈单克隆性1, 4。1.2.2 引物设计和 PCR 对 Jurkat 细胞株 TCR V1 亚家族及TCR V8 亚家族基因序列进行测序分析 , 根据测序结果与 GenBank的序列比对, 分别设计 TCR V1 亚家族及 TCR V8 亚家族的扩增引物, 序列如下 : (1)TCR V1 亚家族 : 上游引物(2 条) F1 5ATTGCTAGCCACTG
11、CTCAGCCATGCTCCT3(下划线为 Nhe I 识别序列 ); F2 5ATTGCTAGCCTCCAGCGTGGCCACTGCTC3(下划线为 Nhe 5I 识别序列 ); 下游引物 R1(共用) 5CGGAATTCCTACTCACTCATAATGCTGTTGTTGAAG3(下划线为 EcoR I 识别序列, 方框内为能适应 3 种不同读码框的终止密码子); (2)TCR V8 亚家族 : 上游引物 F3 5GCTTCTAGAATATTCCACATCTGCTCTCACTCT3（下划线为Xba I 识别序列）; 下游引物 R2 5TACGTCGACCTACTCACTCAGAGCCCGTA
12、GAACTGGACTTGA3（下划线为 Sal I 识别序列, 方框内为能适应 3 种不同读码框的终止密码子）5。分别以各自的引物对 Jurkat 细胞株 TCR V1 亚家族及 TCR V8 亚家族基因序列进行 PCR 扩增。PCR 反应总体系为 25 L, 模板 cDNA 量为 2 L, 反应条件为: 94 1 min（首次3 min）, 60 1 min, 72 1 min（末次为 5 min）, 共 35 个循环, 产物 4保存备用。1.2.3 真核表达载体的构建及鉴定 将 PCR 扩增的 TCR V1亚家族基因片段和 pIRES 质粒进行 Nhe I+EcoR I 双酶切并以E.Z.
13、N.ATM.Kit 从凝胶中回收。按载体 目的基因以 13 的比例(摩尔数比)将 pIRES 载体与 TCR V1 亚家族基因片段混合, T4 DNA连接酶 16连接过夜, 以期将 TCR V1 亚家族基因片段插入pIRES 质粒的多克隆位点 A(MCS A), 将其转化至感受态的大肠杆菌DH5 中, 固态 LB 培养基中 37过夜培养, 挑取单菌落溶于液态LB 培养基中 37震荡扩增。PurelinkTM Quick Plasmid 6Miniprep Kit 小量提取质粒, 双酶切法筛选正确插入 TCR V1 基因片段的转化子, 获得构建成功的 TCR V1F1pIRES 重组子和 TCR
14、 V1F2pIRES 重组子。依照上述方法 , 将 PCR 扩增的 TCR V8 亚家族基因片段和构建成功的 TCR V1F1pIRES 重组子和 TCR V1F2pIRES 重组子进行 Xba I+Sal I 双酶切, 继而连接、 鉴定, 筛选 TCR V8 基因片段正确插入 TCR V1pIRES 载体 MCS B 的重组子。获得 TCR V1F1pIRESTCR V8 和 TCR V1F2pIRESTCR V8 重组子, 将构建的重组子进行测序, 测序结果与原构建序列一致。1.2.4 独特型 TCR V1pIRESTCR V8 表达载体转染A549 细胞和 Molt4 细胞株 用紫外分光
15、光度计测定 TCR V1pIRESTCR V8 质粒的浓度, 将处于对数生长期的 A549 细胞株以 4105 个细胞/孔的密度接种 6 孔板 , 置于 37 50 mL/L CO2 培养箱中培养 24 h 至 80%90%融合后, 参照LipofectamineTM 2000 说明书, 转染在 6 孔板（底部置洁净玻璃板）中进行, 以 pIRES 载体为空白对照, 平行 2 孔转染, 对 Molt4细胞株的转染方式相同。培养 24 h 后全量换液 , 培养 72 h 后加G418 进行筛选（终浓度 600 mg/L）, 每 4 d 换 1 次培养基, 同时加入相同浓度的 G418, 在此筛选条件下培养 20 d 后得到稳定表达细胞系。71.2.5 重组表达载体转染后 TCR V 和 TCR V 基因表达的鉴定 (1)RTPCR 和实时定量 PCR 检测 TCR V 和 TCR V mRNA的表达: 转染 7 d 后各孔收集 3106 细胞（A549 细胞株需胰酶消化）, 提取总 RNA, 合成 cDNA。利用 TCR V1 亚家族及 TCR V8 亚家族序列特异性引物 RTPCR 扩增重组载体的 TCR V1 和TCR V8 基因 CDR3, PCR 按照常规方法进行, 总反应体系为 20 L, 其中含 1 L cDNA, 反应条件为: 94 1 mi
