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1、1牛白细胞黏附缺陷病的牛白细胞功能检测作者：曹宏伟, 马金柱, 夏红兵, 张大生, 朱战波, 崔玉东, 朴范泽【关键词】 牛白细胞黏附缺陷病（BLAD）; 白细胞; 牛1974 年, 世界上首次报道人发生一种容易感染、白细胞增生和趋化、吞噬功能缺陷的疾病, 1984 年确定其病因, 它是一种与白细胞黏附有关的细胞表面糖蛋白整合素表达缺陷所致, 并定名为白细胞黏附缺陷病1 。1983 年报道了牛白细胞黏附缺陷病(bovine leukocyte adhesion deficiency, BLAD)2, 该病是一种常染色体单基因隐性遗传疾病, 病因为白细胞表面整合素CD18（2 ）亚单位 383
2、位碱基由 A 突变为 G, 与之相应的位于胞外高度保守区的 128 位天门冬氨酸突变成甘氨酸, 致使白细胞表面的 2 整合素表达明显减少或缺乏, 白细胞的黏附、 趋化、 吞噬和过氧化物生成等功能下降, 进而导致中性粒细胞不能黏附到血管壁而到达炎症部位发挥病原清除作用, 使机体出现严重的重复感染3 。BLAD 主要发生于 114 个月龄的 Holstein 牛, 且多在犊牛时期死亡, 但 Muller 等4 进一步研究发现,一旦病牛超过 12 月龄, 感染的严重性和频率下降, 而且只需要零星的抗生素治疗即可维持其生存。2004 年 10 月, 我们对成年奶牛进行 BLAD 携带情况调查时, 在大
3、庆市某牛场发现 1 头 3.5 岁 Holstein 奶牛为 BLAD 病牛, 2该牛经常发生感染和不断使用抗生素治疗。为了解该 BLAD 病牛的白细胞功能变化情况, 本研究中对白细胞的黏附、趋化、吞噬和过氧化物生成等功能进行了检测。1 材料和方法1.1 材料患有 BLAD 的 Holstein 奶牛(编号为 1054) 和同龄健康牛（编号为 1038）均来自于黑龙江省大庆市奶牛繁殖育种中心; 酵母菌和酵母聚糖 zymosan 为 Sigma 公司产品; 发光氨 Luminol 为 Aldrich 产品。1.2 方法1.2.1 白细胞的分离和计数以肝素 (20104 U/L)为抗凝剂, 从奶牛
4、的尾静脉中采血 10 mL。将抗凝血以 2 000 r/min 于常温离心 10 min, 血液分为 3 层, 中间层为白细胞层。用移液管先吸掉上层液, 再将白细胞层移到另一离心管内, 加入 6 倍体积的 8.3 g/L NH4Cl 溶液, 37 水浴 5 min, 使带入的红细胞裂解后, 以 2 000 r/min 离心 10 min 沉淀白3细胞, 然后用 Hanks 平衡盐溶液 (HBSS)洗涤白细胞 3 次后, 将白细胞以 5109/L 的密度悬浮于 HBSS 中, 经 Wright Giemsa 染色镜检, 细胞存活状态良好。利用常规血细胞计数方法对以上 BLAD牛和健康牛进行白细胞
5、计数 3 次, 然后取平均值作为最后结果。1.2.2 白细胞黏附性测定将预热 5 min 的 1 mL 含有自体 10%血浆的白细胞（5109 /L）悬液加入尼龙毛柱里, 之后对流出的白细胞计数。根据公式计算白细胞黏附率: 白细胞黏附率=100-（流出细胞数/初始细胞数100） 。1.2.3 白细胞趋化反应测定在琼脂糖凝胶平皿上打两组孔, 每 3 孔为 1 组, 孔的直径为2.5 mm, 孔和孔的距离为 2.5 mm。中央孔加 10 L 的白细胞悬浮液（1109/L）, 外孔加入以自体新鲜血清处理过的酶母聚糖zymosan 10 L, 内孔加入 10 L HBSS 作对照液; 将平板放在含有5
6、 mL/L CO2 的潮湿培养箱中于 37温育 2 h 后, 在平皿中加满 99%的甲醇, 室温 30 min 后, 轻轻倒出甲醇, 再加满 37%甲醛溶液, 室温放置 60 min 后, 除去甲醛溶液, 之后再移去琼脂糖, 用WrightGiemsa 方法对平皿中的白细胞进行染色, 然后用测微目镜4观察细胞的游走情况和趋化性。1.2.4 白细胞吞噬功能测定将 200 L 白细胞（1.51010/L ） 、100 L 稀释血清和 200 L 酵母悬浮液（2.51014/L）混合后, 以低速摇床中 37温育 30 min, 其后, 加入 2mL 冰冷的 HBSS, 再进行 400g 离心 10m
7、in, 在沉淀中加入 2 滴 0.1g/L 的品红染液, 然后用显微镜观察白细胞的吞噬情况。最后计算出在 100 个白细胞中吞噬酵母菌和未吞噬酵母菌的白细胞数, 并得出白细胞的吞噬率。1.2.5 过氧化物生成测定过氧化物生成测定是使用发光氨 Luminol 通过化学发光法检测的。取 96 孔微孔板, 每孔中加入容量为 350L, 其中含 3106个白细胞, CaCl2 浓度为 0.5mmol/L, MgCl2 浓度为 1mmol/L, Luminol 浓度为 10mol/L, HRP 浓度为 50mg/L, 于 37 温育 5 min, 再加入温浴的 35 L 血清调理过的酵母聚糖 zymos
8、an (10 g/L), 用发光检测仪于 37检测每孔的化学发光值5 。2 结果52.1 白细胞计数BLAD 牛和健康牛白细胞均经 3 次计数, 经过计算正常牛白细胞数为 (7.60.22)109/L, BLAD 牛白细胞数为 (27.50.29)109/L, BALD 牛白细胞数约是正常牛的 3.6 倍。2.2 白细胞黏附性测定对白细胞的黏附性进行重复检测, 结果 BLAD 牛白细胞黏附到尼龙纤维上的黏附率要比正常牛白细胞低很多（P0.05）, 说明 BLAD 牛白细胞的黏附功能明显降低（表 1） 。表 1 BLAD 牛和正常牛白细胞的黏附率检测（略）2.3 白细胞趋化反应测定对白细胞趋化反
9、应检测结果为, BLAD 牛白细胞的任意游走范围(R) 为(2.10.25)mm, 趋化反应(C)为(3.30.16)mm; 而正常牛白细胞的游走范围(R)为(2.770.24)mm, 趋化反应 (C)为(4.330.21)mm。BLAD 牛白细胞趋化反应要比正常牛白细胞的趋化反应明显降低（P0.05） 。2.4 白细胞吞噬功能测定6对白细胞吞噬功能检测结果为, 正常白细胞对酵母的吞噬率为 82%左右, 而且在镜下观察到多数白细胞吞噬 25 个酵母, 仅有少数白细胞吞噬 12 个酵母; 相比之下, BLAD 牛白细胞对酵母的吞噬率为 25.7%左右, 观察到大部分白细胞能够吞噬 12 个酵母,
10、 仅有极少数的白细胞能够吞噬 23 个酵母。表明 BLAD 牛白细胞吞噬能力要比正常牛白细胞的吞噬能力明显下降（P0.05） 。2.5 过氧化物生成测定对白细胞过氧化物生成检测结果为: 正常牛白细胞的过氧化物产生随时间的延长而增加, 在 300 s 左右时达到峰值 , 随后下降（图 1）; 相比之下, BLAD 牛白细胞过氧化物产生的量较少, 增加缓慢, 在 900 s 时达到峰值, 且光发射强度约为正常牛白细胞的1/3。结果表明 BLAD 牛白细胞过氧化物生成量比正常牛白细胞明显降低。3 讨论白细胞整合素家族包括 LFAl (CD11a/CD18)、Mac1 (CD11b/CD18) 和 p
11、150, 95 (CD11c/CD18)三种分子, 它们具有共同的 CD18（2）链, 其中 LFA1 在白细胞稳固黏附到血管内皮上和穿过血管内皮的移行中起主要作用, Mac1 是一种主要的吞噬细胞受7体, 同整合素 p150, 95 一起发挥作用, 识别作为配体的纤连蛋白和补体片段 iC3b6 。由于 BLAD 牛白细胞表面整合素亚单位 CD18分子 383 位的碱基由 A 变为 G(A383G), 与之相应的位于胞外高度保守区的 128 位的天门冬氨酸变成了甘氨酸, 致使白细胞表面的CD18 整合素表达明显减少或缺乏, 而使白细胞在炎症反应时不能利用整合素穿过血管壁到达病原侵入部位, 而使
12、机体临床发病。通过对 BLAD 牛白细胞研究表明, 该病牛白细胞的数量明显增加, 这可能是因为整合素亚单位（CD18）的功能缺陷引起白细胞功能下降的代偿性增强所致。另外, 这头 BLAD 牛白细胞的黏附和趋化功能的降低可能与 LFA1 分子功能改变有直接关系 ; BLAD 牛白细胞的吞噬功能明显下降可能与 Mac1 和 p150, 95 二者发挥的调理作用缺陷有一定关系; 调理的酵母聚糖刺激 BLAD 牛白细胞过氧化物产生的减少可能与整合素亚单位（CD18）沟通细胞内外的桥梁作用和细胞信号传导作用的减弱甚至消失有关。本研究对这头病牛白细胞各项白细胞功能进行检测表明, 这头 BLAD 牛白细胞的
13、黏附、趋化、吞噬和过氧化物产生等功能与正常牛白细胞相比均明显降低, 这些研究结果与国外的研究结果相符7 。正是因为如此 , 该病牛在临床上才经常出现感染, 并常常需要使用抗生素进行治疗, 因此增加了养牛成本, 使该牛于 2005 年 11 月被淘汰。本研究中没有对BLAD 牛白细胞的整合素表达量及其亚单位（CD18）构象变化方面进行研究, 同时也没未对 BLAD 牛白细胞中钙离子浓度进行检测, 尚8需今后进一步研究才能够更加深入认识 BLAD 发病机制。【参考文献】1Kishimoto TK, Hollander N, Robert TM, et al. Heterogeneous mutat
14、ions in the beta subunit common to the LFA1, Mac1 and p150, 95 glycoproteins cause leukocyte adhesion deficiencyJ . Cell, 1987, 50: 193-202.2Hagemoser WA. Roth JA, Lofstedt J, et al. Granulocytopathy in a Holstein heiferJ. J Am Vet Med Assoc, 1983, 183: 1093-1094.3Gerardi AS. Bovine leukocyte adhesi
15、on deficiency: a review of a modern disease and its implicationsJ . Res Vet Sci, 1996, 61: 183-186.4Muller KE, Bernadina WE, Kalsbeek HC, et al. Bovine leukocyte adhesion deficiency clinical course and laboratory findings in eight affected animalsJ . Vet Q, 1994, 16: 27-33.5崔玉东. 胞浆 Ca2+和某些激酶对 NADPH 氧化酶激活9和肌动蛋白聚合的作用J. 中国生物化学与分子生物学报, 2001, 17(1): 98-104.6崔玉东, 朴范泽.牛白细胞黏附缺陷病的研究进展J. 中国兽医学报, 2001,21: 204-206.7Nagahata H, Nochi H, Tamoto K, et al. Bovine leukocyte adhesion deficiency in Holstein cattleJ. Can J Vet Res, 1993, 57: 225-261.
