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1、1抗 PTDbcr/abl 单克隆抗体的制备及鉴定【摘要】 目的 : 制备单克隆抗体（mAb ）并初步用于PTDbcr/abl融合蛋白的研究, 为慢性粒细胞白血病的免疫治疗提供实验依据。方法: 在大肠杆菌中表达 PTDbcr/abl融合蛋白, 用所获得的蛋白免疫 BALB/c 小鼠, 常规收集小鼠脾细胞与 Sp2/0 细胞融合, 筛选杂交瘤细胞株的阳性克隆, 并对其进行一系列鉴定。结果: （1）表达 PTDbcr/abl融合蛋白; （2 ）制备了抗PTDbcr/abl融合蛋白 mAb; （3）用 mAb 以多种方法检测PTDbcr/abl融合蛋白, 证实此抗体效价高, 特异性强。结论: 此抗体
2、可用于 PTDbcr/abl融合蛋白的进一步研究。 【关键词】 PTDbcr abl 融合蛋白 单克隆抗体 制备PTDbcr/abl是一种利用基因工程合成的融合蛋白1, 2 。其中 PTD（蛋白转导结构域）是人类免疫缺陷病毒（HIV ）1 所编码的反式激活蛋白 TAT 的一段多肽片段, 具有独特的跨膜转运方式, 其特点是转导速度快, 效率高。Schwarze 等3 发现将 PTD 融合于相对分子质量(Mr)为 151032105 的蛋白时, 可介导这些蛋白从细胞外向细胞内直接跨膜转运。Bcr/Abl 是慢性粒细胞白血病（CML）细胞中特异的 bcr/abl 融合基因所编码的融合蛋白, 其 Mr
3、2为 21104, 具有异常的酪氨酸激酶活性。我们以前已利用基因重组方法构建了 PTDbcr/abl的原核表达质粒, 并在大肠杆菌中获得表达。而且证实表达产物 PTDbcr/abl融合蛋白与 K562 或 HL60细胞共同孵育后, 可进入细胞内 1 。我们用纯化的 PTDbcr/abl融合蛋白抗原免疫 BALB/c 小鼠, 常规收集小鼠脾细胞与 Sp2/0 细胞融合, 筛选杂交瘤细胞株的阳性克隆。经 ELISA、 Western blot及免疫组化方法检验, 证实 mAb 特异性强, 效价高, 可用于PTDcr/abl 融合蛋白的进一步研究。1 材料和方法1.1 材料大肠杆菌 BL21购自 N
4、avagene 公司。表达 PTDbcr/abl融合蛋白的质粒 pET16bPTDbcr/abl、 HL60、 K562 细胞株由本室构建保存; BALB/c 小鼠由第四军医大学实验动物中心提供; 免疫组化试剂盒(链亲和素抗生物素蛋白 过氧化酶免疫组化超敏试剂盒)购自迈新公司 ; 小鼠 IgG 亚类快速定性试纸购于法国 Argen 公司; HRP 标记山羊抗小鼠 IgG 抗体(由华美生物提供); 免疫球蛋白标准亚类试剂购自 Sigma 公司。31.2 方法1.2.1 PTDbcr/abl融合蛋白的表达与纯化质粒 pET16bPTD与质粒 pET16bPTDbcr/abl的制备按照文献1进行。用
5、 pET16bPTDbcr/abl转化大肠杆菌BL21, 取阳性克隆培养扩增, 用 IPTG 进行诱导表达后收集菌体, PBS 悬浮, 超声裂菌, 并用 8 mol/L 脲溶解蛋白, 用 8mol/L 脲（pH 值分别是 8.0、 6.3、 5.9、 4.5）在 NiNTAagarose柱上对蛋白进行亲和层析。收集 pH 为 4.5 及 5.9 的洗脱液, 用 4 mol/L 脲、 2mol/L 脲、 1PBS/1 mol/L NaCl、 1PBS/0.5 mol/L NaCl、 1PBS 进行透析后冻干。从中取 10 mg 干粉溶于 2 mL 三蒸水中, 取 20 L, 加入20 L loa
6、ding buffer, 100 煮沸 10 min, 进行 120 g/L SDSPAGE电泳, 成为蛋白胶。1.2.2 小鼠免疫按参考文献4 进行。取蛋白胶（含蛋白 1） 40 mg与 125 L完全福氏佐剂, 125 L PBS 充分研磨后 , 背部皮下多点注射免疫 BALB/c 小鼠。 2 周后用蛋白胶（含蛋白 1） 40 mg与 125 L不完全福氏佐剂, 125 L PBS 充分研磨后 , 皮下多点注射, 4连续 3 次, 每次间隔 2 周, 第 3 次免疫后 14 d, 用 PTDbcr/abl 纯化蛋白 50 g/500 L小鼠腹腔注射, 加强免疫 1 次, 3 d 后取小鼠脾
7、脏待用。1.2.3 细胞融合取免疫小鼠脾细胞与 Sp2/0 细胞按 101的比例, 在 500 g/L(W/V)PEG 4000 介导下融合, 融合细胞用 HAT 培养基做选择性培养, 37、 50 mL/L CO2 孵箱培养, 7 d 后改用 HT 培养基培养。1.2.4 阳性克隆筛选及克隆化培养采用间接 ELISA 法做交叉筛选。将 PTDbcr/abl融合蛋白和 HisTaxreb107(另一带有 His 标签的蛋白, 文章另发)(对照孔)稀释为 10 mg/L, 包被 96 孔酶标板, 100 L/每孔, 4 包被过夜, 次日用 10 g/L BSA 120 L/孔封闭后, 分别取待测
8、杂交瘤上清液 100 L加入 PTDbcr/abl融合蛋白和 HisTaxreb107包被板中, 4过夜; 用 PBSTween20洗板 5 次, 加 HRP羊抗鼠 IgG(11000稀释) 100 L/孔, 37、 1 h; PBSTween20洗板 5 次, TMB 显色; 2 mol/L H2SO4 终止反应。置酶标仪 450 nm 波长测量 A 值, A4505值大于阴性对照孔 2.1 倍以上为阳性, 选取 PTDbcr/abl融合蛋白阳性而 HisTaxreb107阴性的孔细胞, 采用有限稀释法进行亚克隆, 至所有杂交瘤上清液均呈阳性为建株标准。1.2.5 mAb 的制备及纯化每只
9、BALB/c 小鼠腹腔内注入 0.5 mL 液体石蜡, 1 周后将阳性杂交瘤细胞注入小鼠腹腔内, 5106 杂交瘤细胞/ 只。大约 710 d 后收集腹水, 按常规经饱和硫酸铵盐析、 ProteinG亲和层析进行纯化。用紫外分光光度法测定其浓度, 加入终浓度为 0.1 g/L 叠氮钠防腐 , 直接分装, -20保存。1.2.6 mAb 的效价测定以 PTDbcr/abl融合蛋白为包被抗原, 包板方法同上, 将纯化抗体作 4 倍比稀释, 按 ELISA 法常规测定其 A450 值, 以测定孔A450 值阴性孔 A450 值 2.1 倍为阳性, 计算其效价。1.2.7 mAb 亚类鉴定取纯化腹水,
10、 采用双向琼脂扩散方法进行亚类鉴定, 观察沉淀线的形成。61.2.8 mAb 识别 PTDbcr/abl融合蛋白的特异性鉴定(Western blot)由于 PTDbcr/abl融合蛋白带有 His 标签, 而 His 标签的抗原性又较强, 为了了解 mAb 的主要反应位点是 His 标签抑或PTDbcr/abl, 我们采用另一带有 His 标签的蛋白 HisTaxreb107作对照进行检验, 取 PTDbcr/abl融合蛋白、 K562 细胞裂解物样品和 HisTaxreb107蛋白, 样品经 SDSPAGE电泳后, 转至硝酸纤维膜, 置于 1400鼠血清稀释液中过夜, PBST 洗 3 次
11、, 加入羊抗鼠（辣根过氧化物酶标记）二抗, 37 2 h 后用 ABC 法显色。1.2.9 细胞免疫组织化学染色检测制备含 PTDbcr/abl融合蛋白的 HL60、 K562 细胞方法见参考文献1 。取细胞 HL60、 K562 及含 PTDbcr/abl 融合蛋白的 HL60、 K562 各 5105 甩至用 APES 处理过的玻片, 依次用过氧化物酶阻断液, 1/500 mAb, 生物素标记的羊抗鼠抗体, 链亲合素-过氧化物酶相作用, 加入显色液, 镜下显色 10 min。2 结果2.1 PTDbcr/abl融合蛋白的诱导表达及纯化7用 pET16bbcr/abl表达质粒转化大肠杆菌 B
12、L21, 培养后用 IPTG 进行诱导 , SDSPAGE分析表明, 用 pET16bbcr/abl转化的 BL21 与未转化的 BL21 裂解产物相比, 在 Mr 为 23103 处有一新生蛋白带, 与预期的融合蛋白大小相同（图 1） 。2.2 杂交瘤细胞株的建立本次实验融合细胞接种 3 个 96 孔细胞培养板,融合率为 90.6%,初选阳性孔 14 孔, 阳性率为 5.4%, 经反复筛选和克隆化, 最终得到 3 株仅与 PTDbcr/abl融合蛋白反应而与 HisTaxreb107不发生反应的杂交瘤细胞株, 分别命名为 1C9、 2E3、 3E2。经冻存、 复苏后仍稳定分泌抗 PTDbcr
13、/ab mAb。2.3 mAb 的亚类鉴定免疫双扩散检测 mAb 亚类, 3 株 mAb 均为 IgG 。2.4 抗 PTDbcr/abl mAb 的效价 3 株 mAb 均稀释至能与8PTDbcr/abl免疫原发生特异性反应且 A450 值 阴性孔 A450值 2.1 倍, 3 种 mAb 效价分别是 1C9 112800、 2E3 112800、 3E2 19600, 说明抗 PTDbcr/abl mAb 具有高度活性。2.5 抗 PTDbcr/abl mAb 识别抗原的的特性研究Western blot 结果显示 3 株 mAb 均能与纯化的PTDbcr/abl融合蛋白及 K62 细胞中
14、的天然 bcr/abl 融合蛋白发生特异性反应, 而与 HisTaxreb107无反应。表明抗 PTDbcr/abl mAb 主要识别 bcr/abl 抗原。2.6 bcr/abl 在 K562 细胞中表达的检测以抗 PTDbcr/abl mAb 为一抗, 对 K562、 含PTDbcr/abl融合蛋白的 HL60 进行免疫细胞化学染色的结果显示 , 在 2 种细胞中呈现强阳性反应 , 说明所制备的 mAb 具有较强的生物活性及结合能力, 且具有高度特异性。3 讨论肿瘤的免疫治疗, 尤其是细胞免疫治疗 , 是以肿瘤的抗原提呈为9前提。慢性粒细胞白血病的 bcr/abl 基因所编码的蛋白主要存在
15、于细胞内, 但其多肽片段可以被人 MHC 抗原提呈到细胞表面 5, 6, 此为进行慢性粒细胞白血病的细胞免疫治疗提供了理论依据。 PTD 具有独特的蛋白转导作用, 将 PTD 与 bcr/abl 相连, 旨在提高 bcr/abl 的提呈效率以期引起细胞免疫反应。我们以前的实验已经证明 PTD 可以有效地转导 bcr/abl 进入细胞内1 。在本实验中, 我们成功制备了针对 PTDbcr/abl融合蛋白的 mAb。免疫组化亦证实此 mAb 可有效地与细胞内 PTDbcr/abl相作用。为了纯化 PTDbcr/abl而引入 His 标签, 经 Western blot 检验证实抗PTDbcr/abl融合蛋白 mAb 的主要识别的是 bcr/abl 而非 His 标签, 表明此抗体仅特异识别目的蛋白。我们所建立的杂交瘤细胞株经过反复冻存复苏后仍然长势良好, 连续多次传代后仍能稳定分泌抗 PTDbcr/abl融合蛋白 mAb。此研究不仅为进一步研究PTDbcr/abl融合蛋白的提供了有效的工具, 而且为进一步研究针对 bcr/abl 融合蛋白的细胞内抗体提供依据。【参考文献】1梁英民, 孙 强, 蒋姗姗, 等. PTDbcr/abl融合癌蛋白片段的表达及其跨膜转运J. 细胞与分子免疫学杂志, 2001, 17(4):377-380.2梁英民, 孙 强, 蒋姗姗, 等.
