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1、1抗 CMTM4 多克隆抗体的制备、 纯化和鉴定作者：李婷, 郭晓欢, 王 彧, Markus Plate, 邵陆宁, 宋泉声, 马大龙, 韩文玲【摘要 】 目的: 制备抗 CMTM4 的多肽抗体并鉴定其性能。方法: 通过 TMHMM、 DNAStar 等软件对 CMTM4 的 3 种剪接体, CMTM4v1, v2 和 v3 的蛋白序列进行分析, 选取了 4 段序列合成多肽并与钥孔戚血蓝素（KLH）偶联。其中第 1、 2、 3 条多肽为3 种剪接体共有, 混合后免疫家兔, 制备 Ab1; 而第 4 条多肽为CMTM4v1 所特有, 单独免疫家兔, 制备 Ab2。ELISA 法检测抗体效价。免
2、疫亲和层析法纯化后, 进行 Western blot 和免疫组织化学检测, 鉴定这 2 种抗体的特异性与适用范围。结果: 得到兔抗人CMTM4 多肽抗体 Ab1 和 Ab2, 效价分别达 1105 和 1106。纯化后的 Ab1 用于 Western blot 可特异识别超表达的 CMTM4v1和 v2, 并可用于免疫组织化学实验 ; 而 Ab2 仅可用于 Western blot, 特异性识别超表达的 CMTM4v1。Ab1 还可特异识别小鼠内源性 Cmtm4。结论 : 用多肽免疫家兔制备的 2 种抗 CMTM4 抗体不仅具有较高的效价以及特异性, 并且 Ab1 还可以特异识别小鼠Cmtm4
3、, 为 CMTM4 的功能研究提供了有力的支持。 【关键词】 CMTM4 多肽抗体 免疫亲和纯化2Abstract AIM: To prepare, purify and characterize the polyclonal antibodies against CMTM4. METHODS: Four polypeptides named peptide 1, 2, 3, and 4 were synthesized based on the bioinformatics analysis of the three isoforms of CMTM4, CMTM4v1, v2, and v
4、3, and coupled with keyhole limpet hemocyanin (KLH) for immunization. Among them, peptide 1, 2, and 3, common for CMTM4v1, v2, and v3, were mixed for immunization to prepare the antibody which can recognize all of the three isoforms (Ab1); while peptide 4, which is specific for CMTM4v1, was injected
5、 separately into New Zealand rabbits to prepare the antibody specifically targeting CMTM4v1 (Ab2). ELISA assay was used to detect the titers of the antibodies. After purification by immunoaffinity chromatography, Ab1 and Ab2 were identified by Western blot and immunohistochemistry assays. RESULTS: T
6、he titers of Ab1 and Ab2 were 1105 and 1106, respectively. Western blot confirmed their high specificity. Ab1 could also be used for immunohistochemistry analysis, but Ab2 could not. Immunohistochemistry analysis with Ab1 demonstrated the high expression level of CMTM4 in human testis, which was con
7、sistent with the previous result of 3Northern blot. Moreover, Western blot and immunohistochemistry analysis verified that Ab1 can also recognize mouse Cmtm4. CONCLUSION: Two specific antibodies against human CMTM4 were obtained, which will be helpful for further study.KeywordsCMTM4; Antipeptide ant
8、ibody; Immunoaffinity chromatography purification趋化素样因子（chemokinelike factor, CKLF）和趋化素样因子超家族成员 18（chemokinelike factor superfamily member 18, CKLFSF18）是本研究室在国际上首次报道的一个新基因家族, 其编码产物的结构和功能特点介于经典的趋化因子与4 次跨膜蛋白之间1, 2。由于该家族大部分成员存在不同剪接体, 且每个基因至少有一种剪接体的编码产物具有 MARVEL 结构域, 因此, 2005 年 12 月, CKLFSF18 被国际人类基因命名委
9、员会（HUGO）重新命名为 CMTM18（CKLFlike MARVEL transmembrane domain containing member 18） 。CMTM4 有 3 种剪接体, CMTM4v1、 v2 和 v3, 分别编码234、 208 和 179 个氨基酸; 其中 CMTM4v1 和 v2 是主要形式, 在多种组织中广泛表达; 而 CMTM4v3 仅存在于部分肾脏组织和4胎盘组织中。CMTM4v2 是该基因全长 cDNA 产物; 目前, 在小鼠中仅发现了 Cmtm4v2（简称小鼠 Cmtm4）, 其氨基酸序列与人CMTM4v2 同源性高达 95.7%。CMTM4v1 蛋白羧
10、基端比 v2多 26 个氨基酸。为了进一步研究 CMTM4 的生物学功能, 我们设计了 CMTM4 多肽, 免疫家兔 , 制备多肽抗体; 通过免疫亲和层析方法, 对其进行纯化; 利用 Western blot 和免疫组织化学等实验鉴定其特异性与适用范围。1 材料和方法1.1 材料 新西兰家兔与 C57BL/6N 小鼠购自北京大学医学部动物中心。溴化氰（CNBr）活化的 Sepharose 4B 和硝酸纤维素膜（NC）购自 Amersham Pharmacia biotech 公司; 辣根过氧化物酶（HRP ）标记的羊抗兔 IgG 抗体购自 Sigma 公司; IRDyetTM偶联的二抗购自 L
11、ICOR BIOSCIENCE 公司。弗氏佐剂购自 Sigma公司。正常羊血清工作液、 真核细胞表达载体pcDNA3.1/MycHisB()购自 Invitrogen 公司; 真核细胞表达质粒pcDNA3.1/MycHisB()CMTM4v1 和pcDNA3.1/MycHisB()CMTM4v2 为本实验室构建。1.2 方法51.2.1 生物信息学分析及 CMTM4 多肽的设计 利用TMHMM（http:/www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM2.0/ ）软件分析 CMTM4 蛋白跨膜区 ; 利用 DNAstar 软件包(DNASTAR Inc., Madison, WI,
12、 USA)进行多序列比对以及 CMTM4 的抗原性、 亲疏水性及表面暴露性预测3。综合考虑上述因素以及 CMTM4 的 3种剪接体的序列特点, 选取 CMTM4 蛋白中 4 段氨基酸序列（命名为 peptide1、 2、 3、 4。其中 1、 2、 3 为 3 种剪接体共有; 4为 CMTM4v1 特有）, 在蛋白质数据库中验证其特异性后, 委托杭州中肽公司进行多肽合成以及 KLH 偶联。1.2.2 CMTM4 多肽抗体的制备 将与 KLH 偶联的peptide1、 2、 3 等质量混合后免疫家兔, 制备可以识别全部 3 种剪接体的多肽抗体（Ab1）; 偶联 KLH 的 peptide 4 单
13、独免疫家兔, 制备特异针对 CMTM4v1 的抗体（Ab2） 。初次免疫将 300 g 的peptide 1、 2、 3 混合多肽以及 100 g 的 peptide 4 分别用PBS 稀释至 1 mL 后与等体积的完全弗氏佐剂充分混合, 于两足蹠部各 0.25 mL 皮下注射 , 其余后背部皮下多点（6 点）注射。之后每2 周加强免疫 1 次, 使用同样剂量多肽与等体积的不完全弗氏佐剂混合后, 全部后背部皮下多点（8 点）注射4。第 2 次加强免疫后 14 d 取兔耳缘静脉血样检测效价, 至效价达 1105 以上后, 将家兔处死, 心脏取血获取血清。61.2.3 CMTM4 多肽抗体效价测定
14、 将 CMTM4 裸肽稀释至 1 mg/L 包被 ELISA 酶标板 , 100 L/孔, 10 g/L BSA 37封闭 2 h。 PBST（PBS+0.5 mL/L Tween20）洗涤 3 次后, 加入不同稀释度（1104, 1105, 15105, 1106）的免疫前后兔血清, 100 L/孔, 37孵育 2 h。彻底洗涤后加入 HRP 标记的羊抗兔二抗（15000）, 37孵育 1 h 后洗涤, 加入 TMB 底物室温避光显色15 min, 加入 2 mol/L H2SO4 终止反应, 使用酶标仪测定 A490 值, 高于免疫前血清 10 倍为阳性。1.2.4 CMTM4 多肽抗体亲
15、和纯化 首先将 peptide 1、 2 和3 裸肽各 3 mg 的混合物以及 peptide 4 裸肽 4 mg 分别与 CNBr活化的 Sepharose 4B 偶联, 制备多肽亲和层析柱。PBS 冲洗并平衡柱料后, 分别加入 PBS 稀释的相应的免疫后血清 4旋转孵育过夜。PBS 冲洗柱料后使用 pH2.4、 0.1 mol/L 甘氨酸缓冲液洗脱。收集洗脱液, 立即用 1/20 体积的 1 mol/L TrisHCl (pH9.0)中和并透析至 PBS 中。BCA 法定量, SDSPAGE 电泳鉴定抗体纯度。1.2.5 CMTM4 多肽抗体特异性和适用范围的鉴定 （1）Western b
16、lot 检测: 用电穿孔法将真核细胞表达质粒pcDNA3.1/MycHisB(-)CMTM4v1、 pcDNA3.1/MycHisB(-)CMTM4v2 以及空载体对照pcDNA3.1/MycHisB(-)分别转染至 HeLa 细胞（2 mm 电转杯, 7120 v, 20 ms） 。48 h 后用 RIPA 裂解液（50 mmol/L TrisHCl pH7.5, 150 mmol/L NaCl, 1 mL/L NP40, 5 g/L 脱氧胆酸钠, 1 g/L SDS）裂解细胞。将细胞裂解物与 SDS 蛋白上样缓冲液混合煮沸 10 min, 离心取上清进行 125 g/L SDSPAGE 电泳。湿式法电转至 NC 膜上。50 g/L 脱脂奶粉（TBST 配制）室温封闭 1 h, 分别加入纯化后的 CMTM4
