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1、1抗 BCG Hsp65 单克隆抗体的鉴定及应用研究作者：尹晓光, 吴秀丽, 万敏, 张培因, 王艳媚 , 王丽颖, 于永利【摘要 】 目的: 对制备的 5 株抗 BCG Hsp65 单克隆抗体（Hsp65 mAb）做进一步鉴定和应用。方法: 采用 ELISA 方法对mAb 的效价、 亚类和结合抗原表位特性进行鉴定, 应用 mAb 对Hsp65 融合蛋白进行了 Western blot 和免疫荧光检测。结果: 5 株mAb 的类型均为 IgG, 其中C1 和C3 株 mAb 为 IgG1 亚类, A5、 C3 和D6 株 mAb 为 IgG2a 亚类。 抗原表位竞争结合分析显示, 在配对的不同
2、亚类 mAb 中, 存在着结合 Hsp65 表面不同抗原表位的 mAb。通过 Western blot 检测证实, Hsp65 mAb对 Hsp65-MUC1 检测结果, 与 MUC1 mAb 的一致。细胞免疫荧光检测显示, 制备的 mAb 能够识别通过蛋白装载进入树突状细胞内的 Hsp65-PSA。结论 : 获得的 Hsp65 mAb 可做为检测工具, 用于研究 BCG Hsp65 及其融合蛋白的功能和表达。 【关键词】 BCG 热休克蛋白 单克隆抗体来自分枝杆菌 BCG 的 Mr 65000 热休克蛋白（Hsp65）具有交叉提呈外源性抗原肽的功能, 已经引起免疫学家的高度重视1, 一些用于
3、治疗肿瘤和病毒性疾病的 Hsp65 融合蛋白类疫苗2已被研制2, 3 。为研究此类疫苗的作用机制和纯化工艺, 我们先前利用 Hsp65 融合蛋白制备了 5 株 Hsp65 单克隆抗体（mAb）4, 本实验中我们对上述 mAb 做进一步鉴定 , 并初步应用制备的 mAb 对 Hsp65 融合蛋白进行了研究。1 材料和方法1.1 材料 Hsp65、 Hsp65-MUC1、 Hsp65-PSA 和Hsp65-GFP 蛋白及分泌 Hsp65 mAb 的 5 株杂交瘤细胞由吉林大学基础医学院分子生物学教研室制备; HRP-羊抗鼠 IgG、 HRP-羊抗鼠 IgG1 和 HRP-羊抗鼠 IgG2a 及重组
4、人的白介素 4（rhIL-4）和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（rhGM-CSF）购自 BD 公司; CY3-羊抗鼠 IgG 和 MUC1 mAb 购自 Sigma 公司; 淋巴细胞分离液为TBD 公司产品; 胎牛血清购自杭州四季青生物有限公司; 来自健康人外周血的浓缩白细胞由长春中心血站提供。1.2 方法1.2.1 mAb 效价和亚类检测 将杂交瘤细胞进行培养并制备腹水, 用完全培养液（medium）对各株杂交瘤细胞的培养上清或腹水做 10 倍倍比稀释。在抗体效价检测时, 以包被酶标条的 Hsp65蛋白为检测抗原, 系列稀释的培养上清和腹水为检测样品, medium3为阴性对照, HRP-羊抗
5、小鼠 IgG 为示踪抗体, 用常规 ELISA 方法检测4 。在抗体亚类检测时 , 以杂交瘤细胞培养上清做为检测样品, HRP-羊抗小鼠 IgG1 或 HRP-羊抗小鼠 IgG2a 为示踪抗体, 其他同抗体效价检测过程。1.2.2 mAb 识别抗原表位分析 检测过程参照传统 ELISA 方法5, 并进行了改动。根据上述的 mAb 亚类检测结果, 在 IgG1和 IgG2a 亚类 mAb 之间进行抗体配对。将配对的 mAb 先后与相同的 Hsp65 抗原反应, 通过检测后一种亚类 mAb 结合到固相抗原上的量, 判断配对 mAb 间是否存在抗原表位竞争结合作用。具体过程如下: 在包被 Hsp65
6、 重组蛋白的酶标条中 , 先加入 0.1 mL IgG2a亚类 mAb（做为抑制抗体）或 0.1 mL medium（做为阴性对照）, 每种样品设 3 复孔。经过温浴反应和适当冲洗, 每孔均加入 0.1 mL IgG1 亚类 mAb（做为结合抗体） 。经过温浴和冲洗, 加入 0.1 mL HRP-羊抗小鼠 IgG1（做为示踪抗体） 。酶标条用 DAB 底物显色后, 在 492nm 波长下检测样品的光密度值（A492）, 结果用 SPSS 软件统计分析。依据各 mAb 组与 medium 阴性对照组之间的 A492值是否存在明显差异, 判断 IgG2a 亚类 mAb 与配对的 IgG1 亚类mA
7、b 之间, 结合到 Hsp65 抗原上位点的空间位置关系。1.2.3 Western blot 检测 对不同条件诱导表达的 Hsp65-MUC1 菌体裂解蛋白和纯化蛋白, 经 SDS-PAGE 电泳分离后, 进行4蛋白染色和转膜。应用 Hsp65 mAb 和 MUC1 mAb, 对各自的蛋白转移膜进行 Western blot 检测, 将 Hsp65-MUC1 的化学发光结果与考马斯亮蓝染色结果进行比较。1.2.4 树突状细胞（ DC）的分离、 培养和装载蛋白 来自健康献血者的浓缩白细胞, 通过淋巴细胞分离液、 密度梯度离心和聚苯乙烯培养板黏附过程, 分离出人外周血中的单核细胞6 。将细胞按
8、1109/L 的浓度接种 12 孔培养板（完全培养液为含 100 mL/L 牛血清的 IMDM, 条件培养液为含 5105 IU/L rhIL-4 和rhGM-CSF 的完全培养液）, 用条件培养液诱导培养的单核细胞转化成 DC。当培养到第 5 天时, 用完全培养液稀释 DC 至 11010/L浓度, 取 20 L DC 悬液, 滴加在 11 cm 的玻璃盖玻片上, 并在培养箱内培养 1 h, 用于制备 DC 爬片。 经过适当冲洗后, 获得的 DC爬片被分成 2 组, 各自装载 Hsp65-PSA 和 Hsp65-GFP 蛋白。装载的蛋白浓度为 1 g/L, 装载的时间为 0.5 h, 装载的
9、过程在 37、 50 mL/L CO2 培养箱内完成。1.2.5 细胞免疫荧光检测 经 PBS 冲洗后, 装载 Hsp65-GFP的 DC 直接在激光共聚焦显微镜 (Olympus FV500)下观察。装载Hsp65-PSA 的 DC, 经过 40 g/L 多聚甲醛固定、 5 mL/L Triton X-100 透化处理和 100 mL/L 牛血清 PBS 封闭后, 用A5 株Hsp65 mAb 及 CY3-羊抗鼠 IgG 进行细胞免疫荧光染色, 染色结果5在激光共聚焦显微镜下观察。2 结果2.1 mAb 效价和亚类检测 ELISA 检测结果显示 : 培养上清中的抗体效价均为 1103, 腹水
10、中的抗体效价在 11061108 之间。5 株细胞分泌的抗体均为 IgG 类抗体, 其中C1 和C3 细胞株分泌的抗体为 IgG1 亚类, A5、 D6 和C3 为 IgG2a。2.2 mAb 识别 Hsp65 表位分析 为了分析制备的 mAb 结合在 Hsp65 抗原上的表位, 在空间位置上的相互关系, 我们应用间接ELISA, 对A5、 D6 和C3 株与C1 和C3 株之间配对mAb, 进行了抗原表位竞争结合分析, SPSS 统计结果（图 1）, C3 与C1 或C3 之间存在抗原表位竞争结合抑制作用（aP0.01, bP0.05 vs medium 组相比）, 但A5 和D6与C1 和
11、C3 之间无竞争抑制作用, 说明 C1 与A5 或D6、 C3 与A5 或D6 株配对抗体, 是结合在空间位置较远的不同抗原表位上, 它们在检测 Hsp65 融合蛋白时可匹配使用。图 1 抗体识别 Hsp65 表位分析（略）aP0.01, bP0.05 vs medium 组.62.3 Western blot 检测 Hsp65-MUC1 研究制备的 Hsp65 mAb 在蛋白疫苗纯化工艺中的应用价值, 用含A5 株 Hsp65 mAb 的培养上清, 对 Hsp65-MUC1 表达菌的菌体裂解蛋白和纯化蛋白进行 Western blot 检测, 同时用 MUC1 mAb 做对照检测抗体。结果（
12、图 2）, 菌体裂解蛋白中的主要表达蛋白（25 泳道）与纯化蛋白（1 泳道）的 Mr 均为 80000 左右, 在不同诱导条件下, 工程菌表达目的蛋白的量有所不同（A） 。Hsp65 mAb 介导的 Western blot 检测结果（ B）, 与 MUC1 mAb 的检测结果基本一致 , 但MUC1 mAb 可检测到一些降解带（C ） 。图 2 Hsp65-MUC1 的检测（略）A: SDS-PAGE 检测; B: Hsp65 mAb 介导的 Western blot检测; C: MUC1 mAb 介导的 Western blot 检测; M: 蛋白 marker; 1: 纯化蛋白; 2-5
13、: 菌体裂解蛋白.2.4 免疫荧光检测 DC 装载的 Hsp65-PSA 经 Hsp65 mAb和 CY3-羊抗鼠 IgG 间接免疫染色, 装载 Hsp65-PSA 的 DC 在激光共聚焦显微镜下观察结果（图 3）, 在细胞质内 , 充满被 CY3 红色荧光示踪的不均匀颗粒和团块状聚集的 Hsp65-PSA 蛋白, 细胞核未见染色（A） 。DIC 图像显示, DC 贴壁生长, 形态正常, 可见细胞核（B） 。为证实 Hsp65 mAb 对装载 Hsp65-PSA 的 DC 免疫检测结7果的准确性, 我们同期用 DC 装载了 Hsp65-GFP 做为对比, 根据GFP 的示踪, 判断 Hsp65
14、 融合蛋白通过装载进入 DC 后的聚集位置, 结果在激光共聚焦显微镜下观察显示在装载 Hsp65-GFP 的 DC 胞质内, 存在颗粒和团块状的绿色荧光物（C）, 其分布特点与Hsp65-PSA 免疫荧光染色结果基本一致。说明我们利用制备的Hsp65 mAb, 检测细胞内的 Hsp65 融合蛋白的结果是灵敏和可靠的。图 3 装载不同蛋白 DC 的显微镜图像（600） （略）A: 装载 Hsp65-PSA 蛋白 DC 的 CY3 荧光图像; B: A 图中DC 的 DIC 图像; C: 装载 Hsp65-GFP 蛋白 DC 的 GFP 荧光图像.3 讨论在 Hsp65 及其融合蛋白功能研究中 ,
15、 mAb 是个有用的检测工具, 我们先前利用不同的 Hsp65 重组蛋白制备了 Hsp65 mAb, 并对 5 株杂交瘤的特性进行了鉴定 , 本实验中对制备的 mAb 做进一步应用研究。Hsp65 具有的分子伴侣功能和刺激细胞分泌细胞因子的能力 , 与其寡聚体和多聚体形成的特殊空间结构密切相关, 对 Hsp65 蛋白8晶体结构研究显示, 其空间构象是由氨基酸主链和侧链电荷相互作用, 以及氢键、 疏水键和范得华力等共同维系着 7 。当 Hsp65的 C 末端偶联不同的外源性抗原时, 其空间结构可能发生改变。我们在制备杂交瘤时, 尽管采用了不同 Hsp65 融合蛋白进行动物免疫、杂交瘤筛选和抗体鉴
16、定, 也有必要对抗体结合抗原的表位做进一步研究。基于抗体亚类和效价检测基础上, 我们设计不同亚类抗体间竞争结合抗原表位的酶联免疫检测实验, 结果证明制备的 IgG1 与IgG2a 亚类 mAb 之间, 存在结合相同和相近, 及不同抗原表位的配对抗体, 说明 Hsp65 分子表面存在着多个主要免疫显性表位, 这同文献报道的 Hsp65 存在的主要免疫显性表位的观点相一致 8 。抗体的应用价值需要在实际工作中进行检验。我们用制备的 Hsp65 mAb 与进口的 MUC1 mAb 做了对比检测, 显示 2 种 mAb 对结构完整的融合蛋白分子的检测结果是一致的, 不同的是 MUC1 mAb能够检测出蛋白杂交带, 这可能与 Hsp65-MUC1 重组蛋白中的MUC1 的串联重复表位的构建有关, 只要我们在应用 Hsp65
