《抗11β羟类固醇脱氢酶1的单克隆抗体的制备与鉴定》由会员分享，可在线阅读，更多相关《抗11β羟类固醇脱氢酶1的单克隆抗体的制备与鉴定（12页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1抗 11羟类固醇脱氢酶 1 的单克隆抗体的制备与鉴定作者：王婉, 杨金菊, 刘莉, 陈志成, 高媛, 高建恩, 安立国, 孙启鸿【摘要 】 目的 : 制备抗人 11羟类固醇脱氢酶 1（homo sapiens hydroxysteroid 11beta dehydrogenase 1, HSD11B1）的单克隆抗体（mAb）并初步鉴定其特性。方法: 将正常成人肝组织匀浆离心并分离线粒体, 用线粒体总蛋白免疫 BALB/c小鼠, 采用杂交瘤技术制备 mAb, 并通过间接 ELISA 法、 Western blot、 免疫组化的方法对 mAb 进行特性鉴定, 通过免疫沉淀、 UniZAP XR
2、肝脏 cDNA 表达文库筛选鉴定抗原。结果: 通过间接ELISA 筛选获得 1 株可稳定分泌抗人 HSD11B1 mAb 的杂交瘤细胞系。其分泌的 mAb 的 Ig 亚类( 型)为 IgG1（）, Western blot 结果显示该 mAb 可以特异地识别相对分子质量(Mr)为 35000 的蛋白; 应用 mAb CBF245 对人肝脏 cDNA 表达文库（UniZAP XR）进行筛选, 阳性噬菌斑测序结果显示 5 个阳性克隆插入序列均为HSD11B1。结论: mAb BAD062 特异地识别抗原 HSD11B1, 该mAb 可用于 ELISA 检测、 Western blot、 免疫组化和
3、免疫沉淀实验, 为 HSD11B1 的研究提供了有力的工具。 2【关键词】 HSD11B1 单克隆抗体 线粒体Abstract AIM: To generate and identify monoclonal antibodies (mAb) against homo sapiens hydroxysteroid 11beta dehydrogenase 1 (HSD11B1). METHODS: Normal human liver tissues were homogenized, and mitochondria were isolated by differential centrif
4、ugation. The total mitochondrial proteins were used to immunize BALB/c mice to generate mAb by hybridoma technique. The mAb were characterized by ELISA, Western blot and immunohistochemistry. The antibody specificity was identified by immunoprecipitation (IP), and confirmed by UniZAP expression libr
5、ary screening. RESULTS: One hybridoma CBF245 secreting specific mAb against HSD11B1 was established. The Ig subclass of this mAb was IgG1, and it could be used in ELISA, Western blot, immunohistochemistry. Our data showed that the antigen recognized by CBF245 mAb was localized in the hepatocyte cyto
6、plasm, with molecular weight of Mr 35 000 in the mitochondria of human liver tissue. The CBF245 mAb was further confirmed by immunoscreening of UniZAP XR liver cDNA expression library. CONCLUSION: A hybridoma cell line stably secreting 3specific mAb against HSD11B1 is established and characterized.
7、This mAb reacted with HSD11B1 in ELISA, Western blot, immunohistochemistry assay, IP, and would be very useful for the HSD11B1 studies.KeywordsHSD11B1; mAb; mitochondria11羟类固醇脱氢酶 1（homo sapiens hydroxysteroid 11beta dehydrogenase 1, HSD11B1）属于短链脱氢 /还原酶蛋白超家族(SDR), 为相对分子质量(Mr)为 34000 的糖蛋白。此酶主要以糖基化的形式存
8、在于微粒体, 其作用依赖于辅酶 NADP, 在体内负责活性的糖皮质激素向其无活性前体的转换, 调节局部糖皮质激素浓度, 并决定糖皮质激素流向其受体1 。代谢综合征糖皮质激素敏感性增加, HSD11B1 调节异常, 可能是肥胖、 糖耐量低减、 高血压和心血管疾病等代谢综合征重要发病机制之一, 选择性HSD11B1 抑制剂有望成为其治疗靶点。HSD11B1 在体内广泛表达, 多分布于肝、 肺、 脂肪组织、 脉管系统、 卵巢及中枢神经系统。我们在成人肝脏线粒体单克隆抗体(mAb)库的建立中, 应用线粒体总蛋白免疫 BALB/c 小鼠制备 mAb, 其中 1 株为鼠抗人 HSD11B1 mAb, 并对
9、其特异性进行了鉴定, 为进一步研究 HSD11B1 的作用奠定了基础。41 材料和方法1.1 材料 免疫和筛选用成人肝组织线粒体总蛋白, 由本室制备; 弗氏佐剂为 Sigma 公司产品; 羊抗鼠 IgGHRP 为中山公司产品; 蛋白酶抑制剂为 Roche 公司产品; BCA 蛋白定量试剂盒为Pierce 公司产品; cDNA 表达文库为美国 Stratagene 公司产品; PVDF 膜、 ECL 反应试剂盒均为 Amersham 公司产品; DY89型电动玻璃匀浆机构自宁波新芝生物科技股份有限公司。1.2 方法1.2.1 成人肝组织线粒体总蛋白抗原的制备 成人肝组织匀浆700 750 r/m
10、in, 10 g 组织加 40 mL 匀浆缓冲液 800 g 离心 10 min, 取上清, 10000 g 离心 10 min, 沉淀即为线粒体, 用匀浆缓冲液洗 2 次2。用 RIPA 裂解液裂解线粒体样品, 离心后取上清, 获得线粒体总蛋白。采用 BCA 法测定蛋白浓度, 计算线粒体的得率, 通过测定匀浆液和分离的线粒体中的琥珀酸脱氢酶的活性计算线粒体的富集度, SDSPAGE 鉴定抗原的 Mr。1.2.2 鼠抗人 mAb 的制备 首次免疫免将线粒体总蛋白 1 mg 与等体积弗氏完全佐剂混合后进行充分乳化, 多点皮下注射。首次免疫后 4 周加强免疫 1 次, 1 周后经尾静脉取血, 分离
11、血清, ELISA5法包被线粒体总蛋白 10 g/L 测定效价。融合前 3 d 进行加强免疫, 取小鼠脾细胞与 X653 细胞进行细胞融合, 采用杂交瘤技术制备mAb。1.2.3 抗体识别抗原的鉴定 （1）免疫沉淀 : 应用 CBF245 mAb 从线粒体总蛋白中免疫沉淀相应的抗原, 进一步还原SDSPAGE 电泳, 电转至 PVDF 膜上。用 50 g/L 脱脂奶粉室温下封闭 1 h, 然后加入 12000 稀释的 mAb, 室温下孵育 2 h（或 4过夜）, TBST 缓冲液洗膜后 , 加入羊抗鼠 IgGHRP 抗体（15000稀释）, 室温下孵育 1 h, TBST 缓冲液洗膜后, EC
12、L 法显色。 （2）抗原的 UniZAP XR 人肝脏 cDNA 表达文库筛选: 取大肠杆菌XL1BLUE MRF过夜培养菌接种于 LB 培养液中, 37 震荡培养至 A600 为 0.7 左右, 3000 r/min 下离心 10 min, 用 10 mmol/L的硫酸镁重悬细菌沉淀至 A600 为 0.5, 取适当稀释的文库 60 L（含约 50000 个噬菌体）与 600 L 重悬的 XL1BLUE MRF混匀后 37温育 20 min, 铺至 150 mm 的 NZYLB 平板上, 42倒置培养至噬菌斑模糊可见, 将浸泡过 IPTG 的 NC 膜覆盖表面, 37继续培养 3.5 h,
13、用防水墨水定位后, 剥离滤膜, 进行常规 Dot blot 检测。在原位板上回收阳性克隆, 用 ExAssist 辅助噬菌体进行体内剪切、 测序及 Western blot 分析。1.2.4 mAb 的鉴定 （1 ）Western blot 分析: 线粒体总蛋白6经还原 SDSPAGE 后, 电转至 PVDF 膜上。用 50 g/L 脱脂奶粉室温下封闭 1 h, 然后加入 12000 稀释的 mAb, 室温下孵育 2 h（或 4 过夜）, TBST 缓冲液洗膜后, 加入羊抗鼠 IgGHRP 抗体（15000 稀释）, 室温下孵育 1 h, TBST 缓冲液洗膜后, ECL 法显色。 （2）免疫
14、组化鉴定 : 用丙酮固定的冰冻成人肝组织切片, PBST浸洗 5 min 后每个组织片滴加 25 mg/L 的 Avidin 50 L, 室温孵育15 min, 滴加 30 mL/L H2O2甲醇, 室温孵育 15 min。滴加正常羊血清室温下封闭 30 min, 加入 1100 稀释的鼠抗人 HSD11B1 mAb, 4孵育过夜。PBS 洗片后加入羊抗鼠 IgGHRP, 37 孵育30 min, PBS 洗片后进行 DAB 显色, 苏木素复染, 返蓝后封片。2 结果2.1 成人肝组织线粒体总蛋白抗原的制备 通过差速离心方法分离线粒体, 每克肝组织可得到 810 mg 线粒体蛋白。通过测定琥珀
15、酸脱氢酶活性并计算线粒体富集度, 多次结果显示为线粒体富集度为 47 倍, 成人肝组织线粒体总蛋白经还原 SDSPAGE, 显示其 Mr 主要分布在 2500075000 之间（图 1）, 与文献报道一致3, 可作为免疫动物的抗原。2.2 鼠抗人 mAb 的制备及初步鉴定 应用细胞融合、 筛选和克隆化, 获得 1 株抗人肝脏线粒体阳性的细胞株 CBF245, 其亚类7（型）为 IgG1（） 。2.3 抗体识别抗原的鉴定 （1 ）抗原的免疫沉淀鉴定（图2）: 泳道 1 用正常鼠血清免疫沉淀线粒体作为阴性对照, 泳道 2 为CBF245 免疫沉淀线粒体的结果。Western blot 和 IP 结
16、果显示, CBF245 特异识别成人肝线粒体组织中 Mr 为 35000 的蛋白（箭头所示）, 泳道 1 和 2 中鼠 mAb 重链亦可见显色。 （2）抗原的UniZAP XR 人肝脏 cDAN 表达文库筛选 : 用 CBF245 的杂交瘤细胞培养上清对 UniZAP XR 人肝脏 cDNA 表达文库进行第 1 轮筛选, 铺板密度为 50000 个噬菌体/150 mm 平板, 以保证在一张 NC膜上尽可能多的增加免疫筛选的噬菌斑数, 经过第 1 轮筛选, 共得到了 5 个强阳性噬菌斑（图 3A）, 挖取此 5 个阳性噬菌斑混合后进行第 2 轮筛选, 铺板密度为 1000 个噬菌体/150 mm 平板, 以获得可以分离的独立克隆。经第 2 轮筛选后, 阳性噬菌体得到大大的富集, 得到了单克隆的阳性噬菌斑 15 个（图 3B） 。分离其中的 5
