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1、血尿琥珀酰丙酮检测在酪氨酸血症-I 型诊断中的应用（中华儿科. 全网发布：2012-09-06 15:12 发表者： 韩连书 1175 人已访问 酪氨酸血症 I 型(tyrosinemla type I)是由于肝、肾组织中酪氨酸代谢的终末酶富马酰乙酰乙酸水解酶缺（Fumarylacetoacetase，FAH)缺陷，导致酪氨酸代障碍所致的一种遗传代谢病（酪氨酸代谢途径见图1），又称肝肾型酪氨酸血症，属于常染色体隐性遗传，本病发病率约为 1/2 000 至 1/100 0001。多数患儿为急性型，起病于新生儿或婴儿期，以肝脏受累显著。少数为晚发型，患儿通常起病于 1 岁以后，以生长发育迟缓、进行
2、性肝硬化、肾小管功能受损、低磷性佝偻病等为主要表现。近几年随着串联质谱和气相色谱-质谱的应用，有关酪氨酸血症 I 型报道越来越多，但由于引起肝病的其他代谢病如 Citrin 蛋白缺乏症、半乳糖血症等，也可引起血酪氨酸增高及尿中酪氨酸代谢产物增高，故两者较难鉴别，常引起误诊。酪氨酸血症 I 型患者血和尿琥珀酰丙酮增高 1,2，后 2 种疾病血和尿琥珀酰丙酮正常。通过总结我科于20032010 诊断的 11 例酪氨酸血症 I 型患者临床及实验室资料，探讨血尿琥珀酰丙酮检测在酪氨酸血症-I 型诊断中的价值。对象与方法一、对象临床表现为肝肿大，血酪氨酸增高的 190 例患儿。其中男 103 例，女 8
3、7 例；年龄均值 8 个月（3 天-14岁）。二、方法1.常规实验室检测：血、尿常规检查、肝肾功能、血气分析、血糖、血氨、血乳酸、血钙磷镁、肝脏 B 超及肝脏核磁共振等。2.血氨基酸、酰基肉碱检测：采用干血滤纸片法串联质谱技术进行检测，具体方法见参考文献3 。3.血琥珀酰丙酮检测：采用干血滤纸片法串联质谱技术进行检测，参考文献4 ，取直径为 3 mm 的疑似酪氨酸血症患者的干血滤纸片于 96 孔过滤板内，每孔加入 100 l 80%乙腈（含琥珀酰丙酮内标及水合肼），65 孵育 30 min，过滤至另一 96 孔板，氮气吹干后每孔加入 100 l 甲醇，5 min 后氮气吹干，每孔加入 80%乙
4、腈 100l，取 20l 进行串联质谱检测。由美国疾病控制中心提供琥珀酰丙酮质控干血滤纸片作为质控样品。取 5 个不同浓度 (0、5 、10、25 及 50 mol/L)的琥珀酰丙酮标准品干血滤纸片进行方法准确性验证，其回收率分别为 90%、95%、92%、96%及 95%。参考值上下限为 1600 例健康儿童血琥珀酰丙酮的第 99 和 1 百分位。4.尿有机酸和琥珀酰丙酮检测：尿有机酸和琥珀酰丙酮采用气相色谱- 质谱法进行检测，具体方法见参考文献5。 5. 酪氨酸血症 I 型诊断依据：临床表现：肝肿大，伴或不伴有黄疸； 血酪氨酸增高；血或尿琥珀酰丙酮增高，见参考文献1。结 果根据诊断标准，在
5、 190 例血酪氨酸水平增高患儿中确诊 11 例酪氨酸血症 -I 型患儿，其中男 9 例，女 2 例，年龄 2 个月 6 岁，小于 1 岁 6 例，均无家族史。 9 例患儿已经死亡，2 例存活一、 患者临床及常规实验室检测结果患者临床表现及肝功能见表 1，所有患儿均伴有肝肿大，7 例患儿伴有皮肤黄染。实验室检查显示，所有患儿均出现胆汁酸、碱性磷酸酶、g谷氨酰转肽酶及甲胎蛋白显著增高，部分患儿谷氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶及胆红素增高。肾功能、血糖及钙、磷、镁水平均正常。1 例患儿肝核磁共振显示多发结节，病理活检结果为纤维化结节，非癌变。表 1 11 例患者主要临床表现及肝功能例号 临床表现 肝脏
6、肋下（cm) 甲胎蛋白 碱性磷酸酶 谷氨酸转氨酶 天冬氨酸转氨酶 g谷氨酰转肽酶 总胆红素 直接胆红素1 腹胀，肝大 1 年余 3.0 29.4 956.0 210.0 357.0 642.0 18.5 7.22 皮肤黄染 3 个月 4.0 62.4 792.0 320.0 450.0 253.0 40.2 28.63 腹胀半年 4.5 45.4 1043.0 245.0 472.0 526.0 12.3 7.24 腹胀，肝大 2 年余 3.0 25.4 1210.0 142.0 189.0 241.0 16.9 8.35 肝脾大 10 天 3.0 84.4 835.0 25.0 88.0 1
7、35.0 37.1 16.16 皮肤黄染、腹胀 1 年余 2.0 35.4 1023.0 231.0 354.0 112.0 21.2 6.47 腹泻 1 周，腹围增大3 天 3.5 11.2 782.0 12.0 34.0 546.0 14.3 5.28 皮肤黄染 2 个月 5.5 35.4 1024.0 41.0 12.0 137.0 32.7 22.29 肝大、腹胀 1 个月 5.0 89.4 963.0 136.0 215.0 312.0 29.6 18.910 腹泻 1 周，腹围增大3 天 4.5 126.0 1250.0 33.0 153.0 286.0 47.4 23.811 皮
8、肤黄染 5 个月 5.0 56.9 694.0 69.0 466.0 426.0 38.5 27.2中位数 4.0 45.4 963.0 136.0 215.0 286.0 29.6 16.1注：参考值及单位, 甲胎蛋白:00.03mg/L; 碱性磷酸酶:200350 U/L; 谷氨酸转氨酶:0 75 U/L; 天冬氨酸转氨酶:1042 U/L; g谷氨酰转肽酶 :1673 U/L; 总胆红素:3.520 mmol/L; 直接胆红素:06.8 mmol/L; 胆汁酸: 010 mmol/L二、 血氨基酸、酰基肉碱、琥珀酰丙酮及尿有机酸检测结果 见表 2。所有患者血酪氨酸水平增高，苯丙氨酸水平正
9、常，血琥珀酰丙酮水平均增高，但在 7 例做过尿气相色谱-质谱检测的患儿中仅 4 例尿琥珀酰丙酮增高，3 例未检测出。这 7 例患儿尿 4-羟基苯乙酸、4- 羟基苯乳酸及 4-羟基苯丙酮酸均显著高于参考上限值。表 2 酪氨酸血症型-I 型患者血酪氨酸、苯丙氨酸、琥珀酰丙酮、尿琥珀酰丙酮及有机酸检测结果血 尿( 检测值与 17 烷酸的比值）例号 酪氨酸 苯丙氨酸 酪氨酸/苯丙氨酸 琥珀酰丙酮 琥珀酰丙酮 4-羟基苯乙酸 4-羟基苯乳酸 4-羟基苯丙酮酸1 255.4 103.2 2.5 7.8 2 419.8 65.3 6.4 7.2 3 447.4 86.2 5.2 10.5 4 453.5 9
10、2.3 4.9 7.3 5 234.1 70.2 3.3 10.1 66.2 258.4 1281.4 211.1 6 190.3 63.7 3.0 31.1 0 196.5 607.6 37.1 7 543.3 71.6 7.6 21.3 32.4 194.6 2191.8 482.2 8 324.6 106.2 3.1 17.0 165.6 354.4 1504.8 1275.0 9 201.1 55.5 3.6 13.4 110.1 192.7 2245.9 176.4 10 295.7 56.5 5.2 9.5 0 173.8 881.0 469.9 11 154.7 56.5 2.7
11、 17.4 0 68.1 47.3 35.2 中位数 295.7 70.2 3.6 10.5 32.4 194.6 1281.4 211.1 注：参考值分别为：酪氨酸：20100 mmol/L；苯丙氨酸：20120 mmol/L；酪氨酸/苯丙氨酸：0.52.0；血琥珀酰丙酮：0.5 5.0 mmol/L；尿琥珀酰丙酮：0； 4-羟基苯乙酸：875；4-羟基苯乳酸：07.0 ；4- 羟基苯丙酮酸： 01.0“-” 表示未检测讨 论酪氨酸症 I 型主要是由于富马酰乙酰乙酸水解酶活性降低或缺失，导致酪氨酸代谢途径的终端代谢发生障碍，富马酰乙酰乙酸增高，其上游代谢物酪氨酸、4-羟基苯丙酮酸增多，旁路代
12、谢产物 4-羟基苯乳酸、4-羟基苯乙酸；中间代谢产物马来酰乙酰乙酸、富马酰乙酰乙酸增高，导致其旁路代谢产物琥珀酰乙酰乙酸、琥珀酰丙酮增高。琥珀酰乙酰乙酸、琥珀酰丙酮可与蛋白质的巯基结合，是造成肝、肾损害的主要原因。根据发病年龄，临床将酪氨酸血症 I 型分为急性型(发病年龄2 岁) 6。急性型多在新生儿期起病，病情进展迅速，早期症状类似于新生儿肝炎，如呕吐、腹泻、嗜睡、生长迟缓、肝脾肿大、水肿、黄疸、贫血、血小板减少和出血症状等，常在 39 月龄时死于肝功能衰竭。晚发型通常在 1 岁以后发病，以生长发育迟缓、进行件肝硬化和肾小管功能受损如低磷性佝偻病、糖尿、蛋白尿以及氨基酸尿等，类似 Fanco
13、ni 综合征表现。此病肝肿瘤发生率较高，约30%患儿在 3 岁内并发肝肿瘤，主要是小细胞肝癌。约 40患儿在病程中会有急性末梢神经受累危象发生，表现为易激惹，疼痛性感觉异常，躯干与颈部过度伸展，同时伴有自主神经异常症状，如血压增高、心动过速和肠麻痹等。大部分未治疗患儿在 l0 岁以内死亡。故早期诊断及早期治疗是本病预后好差的关键。本组 11 例均表现为肝损害，1 例出现肝内结节，未发现肾脏及心脏损害。4 例为急性型，4 例为亚急性型，3 例为慢性型。 9 例已经死亡， 2 例存活，提示此病预后不良。酪氨酸血症 I 型由于临床表现不具有特异性，确诊需要依据特殊的实验室检测，包括血氨基酸、琥珀酰丙
14、酮及甲胎蛋白检测,尿 4-羟基苯丙酮酸、4-羟基苯乙酸及 4-羟基苯乳酸及琥珀酰丙酮检测 ,富马酰乙酰乙酸水解酶基因或酶活性检测。由于其他疾病引起的肝脏损害如半乳糖血症、Citrin 蛋白缺乏症等，也可导致血酪氨酸、甲胎蛋白增高 7，尿 4-羟基苯丙酮酸、4-羟基苯乙酸及 4-羟基苯乳酸水平增高，故不能仅凭血酪氨酸或尿 4-羟基苯丙酮酸、4-羟基苯乙酸及 4-羟基苯乳酸水平增高诊断酪氨酸血症 -I 型。已有多项研究证实血或尿琥珀酰丙酮增高是诊断酪氨酸血症-I 型的重要依据，另外，Matern 等 8通过对 21 万余例新生儿筛查 6000 余例酪氨酸增高的新生儿，检测血琥珀酰丙酮，无 1 例增
15、高。确诊为酪氨酸血症-I 型的 56例血琥珀酰丙酮均增高，其中 16 例（28%）血酪氨酸水平正常 8。Al-Dirbashi 等 9通过利用琥珀酰丙酮检测进行新生儿酪氨酸血症-I 型筛查，发现一部分患儿新生儿早期酪氨酸水平正常，提示通过酪氨酸水平检测进行新生儿筛查，可导致假阳性或假阴性，利用琥珀酰丙酮检测可降低假阳性或假阴性。故已有多个国家将检测血琥珀酰丙酮作为新生儿筛查酪氨酸血症-I 型的指标 8-11。本组 11 例血琥珀酰丙酮均增高，7例尿气相色谱-质谱检测中只有 4 例琥珀酰丙酮增高，提示尿气相色谱- 质谱气相色谱-质谱检测琥珀酰丙酮可能出现假阴性。Al-Dirbashi 等 12建
16、立利用串联质谱检测尿琥珀酰丙酮的方法，对 15 例确诊酪为氨酸血症-I 型患者尿进行检测，琥珀酰丙酮均显著增高，说明气相色谱-质谱检测尿琥珀酰丙酮可因为检测前处理方法原因导致假阴性。国内已有 4 篇关于酪氨酸血症-I 型的报道 13-16,只有 1 篇报道是由尿琥珀酰丙酮增高确诊 15，其他 3 篇报道是依据血酪氨酸增高、尿 4-羟基苯乙酸、4- 羟基苯乳酸及 4-羟基苯丙酮酸增高，结合临床及其他实验室结果进行诊断。根据酪氨酸的代谢途径，这些病例也可能是酪氨酸血症-II 型或III 型、Citrin 蛋白缺乏症或继发于肝功能损伤等,因为这些疾病也可以导致上述异常，能否确诊为酪氨酸血症-I 型值得探讨。故对于临床及其他检测结果提示酪氨酸血症-I 型的患者，除通过气相色谱-质谱检测尿有机酸及琥珀酰丙酮外，需要同时检测血琥珀酰丙
