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1、1慢性脑缺血致认知功能障碍大鼠皮层 Rho 激酶表达变化作者：王晓明 徐忠信 莽靖 魏爱宣 赵晴 钱佳丽李宗树【摘要 】 目的 探讨慢性脑缺血致大鼠认知功能障碍与 Rho 激酶（ROCK）及作用产物 平滑肌激动蛋白（SMA）表达变化。方法 健康雄性 Wistar 大鼠 54 只，随机分为假手术组、模型组和法舒地尔组。各组再根据缺血时间分为 3、6 、9 w 三组，每组 6 只。采用2VO 建立慢性脑缺血模型，Morris 水迷宫检测学习记忆功能，免疫组化检测 ROCK2、SMA 表达。结果 与假手术组相比，模型组和法舒地尔组大鼠逃避潜伏期和游泳路径均明显延长（P0.05） ；缺血 3 w 起，
2、缺血组大鼠皮层 ROCK2、SMA 表达明显增高，法舒地尔干预后，大鼠学习记忆成绩不同程度改善，ROCK2、SMA 表达下降，与模型组相比差异显著（P0.05） 。结论 ROCK 参与大鼠慢性脑缺血致认知功能障碍，脑组织存在ROCK 表达上调与功能活化，ROCK 抑制剂法舒地尔能够减轻神经功能损伤从而改善学习记忆功能。 【关键词】 慢性脑缺血; 认知功能; Rho 激酶; 法舒地尔【Abstract】 Objective To investigate the expressions of 2Rho kinase (ROCK) and smooth muscle actin (SMA) in t
3、he rats with cognitive dysfunction due to chronic cerebral ischemia. Methods 54 healthy male Wistar rats were randomly divided into sham operation, model and fasudil groups, then subdivided into 3 subgroups according the 3, 6, 9 w of ischemia time, 6 rats in each subgroup. Chronic cerebral ischemia
4、animal models were established by 2VO. Learning and memory function were tested by Morris water maze, and ROCK2 and SMA expressions were measured by immunohistochemistry. Results The escape latency and swim distance of model and fasudil groups were longer than those of sham operation group（P0.05）. E
5、xpressions of ROCK2 and SMA increased significantly in ischemia group since 3 w of ischemia, with intervention of fasudil, ROCK and SMA expression decreased and cognitive function improved significantly, having obvious difference from those of model group（P0.05）.Conclusions Upregulation and activati
6、on ROCK interfere with cognitive dysfunction due to chronic cerebral ischemia, fasudil has protective effect of neuron and can improve learning and memory function.【Key words】 Chronic cerebral ischemia; Cognitive 3function; Rho kinsase (ROCK); Fasudil慢性脑缺血致认知功能障碍研究已成为研究的热点，其损伤机制尚未阐明。关于 Rho 激酶（ROCK）在
7、慢性脑缺血致认知功能障碍方面研究尚未见报道。本研究首次拟以 ROCK 为靶点，观察慢性脑缺血后产生认知功能障碍神经元 ROCK 及其作用产物 平滑肌激动蛋白（SMA）表达变化，并应用 Rho/ROCK 信号通路的选择性蛋白激酶抑制剂法舒地尔进行干预，以期从 ROCK 角度探讨慢性脑缺血致认知功能障碍脑损伤机制，为其防治提供新的治疗靶点，为临床预防和治疗提供新思路。1 材料与方法1.1 动物分组 健康雄性 Wistar 大鼠 54 只，体重 320340 g，由吉林大学实验动物中心提供，经 Morris 水迷宫实验筛选后，随机分为：假手术组、模型组和法舒地尔组，每组再根据缺血时间分为 3、6、9
8、 w 三组，每组 6 只。1.2 模型建立及给药方法 慢性脑缺血动物模型采用双侧颈总动脉永久性阻断法（2VO） 。盐酸法舒地尔，天津红日药业股份有限公司生产（批号 070206） ，7.5 mg/kg 体重，每日 1 次腹腔注射，连续注射 21 d。其他两组以等量生理盐水灌胃。41.3 Morris 水迷宫实验 采用 Morris 水迷宫检测空间学习记忆能力，Morris 水迷宫由圆形水池、自动摄像机及电脑分析系统组成，数据采集及图像分析均由图像自动监视和处理系统完成。1.4 ROCK2 及 SMA 免疫组织化学染色 免疫组化染色采用SP 法，ROCK2 及 SMA 一抗为武汉博士德公司产品。
9、细胞浆、胞膜染成棕黄色为阳性细胞。应用彩色病理图像分析系统，对所有切片在同一光强度下，每张切片选取 3 个 200镜下视野计数阳性细胞数，以单个标本为单位，取平均值。1.5 统计学分析 数据以 xs 表示，采用 SPSS11.0 软件进行组间方差分析。2 结 果2.1 各组大鼠不同缺血时间学习记忆能力变化 术后大鼠找到平台所用时间越长，在此期间走的距离越长，表明其学习记忆保持能力越差，提示学习记忆受损严重。缺血 3、 6、9 w 时，与假手术组相比，模型组和法舒地尔组大鼠学习记忆成绩均明显下降（P 0.05） ，法舒地尔组各时间点学习记忆成绩均较模型组明显提高（P0.05） 。见表 1。52.
10、2 各组大鼠不同缺血时间 ROCK2 及 SMA 表达变化 假手术组神经细胞数量、形态分布正常，有弱阳性 ROCK2、SMA 表达。缺血 3 w，可见缺血神经元与正常神经元 ROCK2、SMA 阳性表达，表现为细胞浆呈棕黄色，阳性神经元明显多于假手术组（P 0.05） ，缺血 6、9 w 时缺血坏死神经元明显增多，6 w 时ROCK2 阳性表达神经元最为明显，达高峰，9 w 时 SMA 阳性表达神经元达高峰，但与假手术组相比仍有显著差异（P0.05） ，法舒地尔组缺血神经元减少，阳性细胞数也明显减少，与模型组相比差异显著（P0.05） 。见表 2。表 1 各组大鼠不同缺血时间逃避潜伏期和游泳路
11、径的变化表 2 各组大鼠不同缺血时间皮层 ROCK2 及SMA 表达变化3 讨 论慢性脑缺血所致脑低灌注及认知功能障碍是临床上常见的脑损伤之一，发病早期以认知功能障碍损害为主要表现，最终可导致持久或进展性的认知与神经功能障碍。研究表明在低灌注及低代谢状态下，大鼠的学习记忆功能可发生减退1 。本研究结果显示，慢性缺血可使大鼠逃避潜伏期和游泳路径均明显延长，大鼠学习记忆功能发生改变，并随时间延长逐渐加重，表明大鼠由于慢性脑缺血已产生认知功能障碍，组化形态学观察也表明缺血 39 w 可见明显缺血神经元改变，以 9 w 时最为明显，并可见神经元脱失改变。6本研究采用 2VO 方法在成功制备慢性脑缺血致
12、认知功能障碍模型基础上，首次以小 G 蛋白 ROCK 为靶点，探讨慢性脑缺血额叶皮层 ROCK2 及其作用产物 SMA 表达变化。缺血不同时间免疫组化结果显示，缺血 3、 6、9 w 即可见明显缺血改变的神经元，缺血3 w 即可见神经元 ROCK2、SMA 阳性表达，6 w 时 ROCK2 阳性表达达高峰，9 w 时 SMA 阳性表达达高峰，应用 ROCK 抑制剂法舒地尔干预后，缺血神经元减少，阳性细胞数也明显减少。表明 ROCK2 及其作用产物 SMA 的表达参与了慢性脑缺血后神经元损伤，法舒地尔可以抑制 ROCK2 及其作用产物 SMA 表达，可以减轻慢性脑缺血后神经元损伤，Morris
13、水迷宫学习记忆结果显示大鼠认知功能也明显改善，表明 ROCK 抑制法舒地尔通过抑制ROCK2 表达使其作用产物 SMA 表达降低而减轻慢性脑缺血致认知功能障碍。已有研究表明，ROCK 可增强血管内皮细胞的通透性，参与内皮细胞的收缩，并参与多因素诱导的内皮细胞屏障功能的改变，也可通过调节内皮细胞一氧化氮合酶（NOS）表达参与缺血后神经元损伤的发生与发展，ROCK 抑制剂可改善急性脑缺血损伤，也可明显抑制内皮细胞的通透性2 6 。而 ROCK 广泛表达于神经元、血管内皮及炎性细胞，ROCK 活性改变可直接或间接通过其作用产物SMA 表达影响微循环血管结构及收缩性，参与神经元损伤及病7理性神经突触重
14、构，而这些病理生理过程是缺血性脑损伤致认知功能障碍的共同通路。本实验证实 ROCK 抑制剂法舒地尔可对大鼠慢性脑缺血致认知功能障碍产生影响， ROCK 可望成为慢性脑缺血致认知功能障碍的治疗新靶点。【参考文献】1 OBrien JT. Vascular cognitive impairmentJ. Am J Geriatr Psychiatry, 2006; 14: 72433.2 De Sarno P, Shestopal A, Zmijewska RS，et al. Antiapoptotic effects of muscarinic receptor activation are me
15、diated by Rho kinaseJ. Brain Res, 2005；1041(1):1125.3 Yamashita K, Kotani Y, Nakajima Y, et al. Fasudil, a Rho kinase (ROCK) inhibitor, protects against ischemic neuronal damage in vitro and in vivo by acting directly on neuronsJ. Brain Res, 2007；1154:21524. 4 Shin HK, Salomone S, Potts EM, et al. R
16、hokinase inhibition acutely augments blood flow in focal cerebral 8ischemia via endothelial mechanismsJ. Cereb Blood Flow Metab, 2007； 27(5):9981009. 5 Madura T, Kubo T，Tanag M, et al. The Rhoassociated kinase inhibitor fasudil hydrochloride enhances neural regeneration after axotomy in the peripheral nervous systemJ. Plastic Reconstr Surg, 2007; 119(2):52635. 6 Yagita
