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1、蛋黄中胆固醇含量测定方法的研究胆 固 醇 含 量 的 分 析 方 法 有 酶 法 、 比 色 法 、 液 相 色 谱 法 、气 相 色 谱 法 、 液 相 色 谱 -质 谱 联 用 法 等 试 剂 盒 法 是 基 于 酶 法测 定 胆 固 醇 的 原 理 进 行 的 比 色 法 一 种 依 据 显 色 反 应 来 分 析的 传 统 方 法 色 谱 法 是 适 用 范 围 较 广 、 灵 敏 度 较 高 的 分 析 方法 而 高 效 液 相 色 谱 不 需 要 载 气 在 使 用 上 较 气 相 色 谱 和 液 相色 谱 -质 谱 联 用 的 方 法 简 便 6-11 。 本 试 验 对 液 相
2、 色 谱 法 、皂 化 -比 色 法 和 试 剂 盒 法 测 定 蛋 黄 胆 固 醇 的 过 程 和 结 果 进 行研 究 和 比 较 为 鸡 蛋 胆 固 醇 含 量 测 定 工 作 提 供 方 法 指 导 。1 材 料 与 方 法1.1 试 验 材 料蛋 黄 由 市 售 新 鲜 鸡 蛋 中 取 出 胆 固 醇 标 准 品 纯 度 99.7%由 中 国 计 量 科 学 研 究 院 提 供 总 胆 固 醇 试 剂 盒 酶 法 由 北 京 北化 康 泰 临 床 试 剂 有 限 公 司 提 供 显 色 液 为 FeSO4-冰 乙 酸 -浓硫 酸 将 FeSO4100 mg 溶 于 1mL 蒸 馏 水
3、 中 再 加 入 100 mL 冰 乙 酸 混 合 溶 解 然 后 与 100 mL 浓 硫 酸 缓 慢 混 匀 冷 却后 使 用 。 1.2 试 验 方 法 1.2.1 HPLC 法 取 新 鲜 蛋 黄 稀 释 液 浓度 为 0.1 gmL-1 1.0 mL 于 10 mL 离 心 管 中 加 入 95%乙 醇1.0 mL 用 漩 涡 振 荡 器 混 匀 后 加 入 乙 醚 2.5 mL 再 次 混 匀 后加 入 石 油 醚 2.5 mL 震 荡 混 匀 3 000 rpm 离 心 5 min 移 出 上层 萃 取 液 在 低 于 45 下 用 氮 气 吹 干 加 无 水 乙 醇 溶 解 残
4、 余 物2.0 mL 用 0.45 m 有 机 微 孔 滤 膜 过 滤 后 进 样 。 色 谱 条 件 为色 谱 柱 ZORBAXEclipse XDB-C184.6 mm150 mm5 m 流 动相 乙 腈 -异 丙 醇 (4:1)V/V 流 速 0.8 mLmin-1 柱 温 35 检测 波 210 nm 进 样 量 10 L。 取 胆 固 醇 标 准 品 用 色 谱 级 无 水乙 醇 溶 解 配 成 浓 度 为 1 mgmL-1 的 标 准 液 取 标 准 液 稀 释 成不 同 浓 度 01 000 gmL-1 以 胆 固 醇 浓 度 为 横 坐 标 峰 面 积值 为 纵 坐 标 制 作
5、 标 准 曲 线 。 采 用 外 标 法 定 量 分 析 样 品 中 胆固 醇 含 量 。1.2.2 皂 化 比 色 法 称 取 鲜 蛋 黄 100 mg 于 25 mL 试 管 中 加 入 KOH-甲 醇 溶液 5 mL200 gL-1 漩 涡 震 荡 混 匀 置 于 80 水 浴 恒 温 振 荡器 中 皂 化 10 min 取 出 冷 却 至 室 温 加 入 正 己 烷 10 mL 漩 涡 震荡 混 匀 静 置 将 上 层 液 体 移 入 10 mL 离 心 管 中 3 000 rpm 离心 10 min 取 出 上 清 液 60 下 用 氮 气 吹 干 。 然 后 加 入 冰 乙酸 1
6、mL 溶 解 残 余 物 再 加 入 显 色 液 3 mL 于 60 水 浴 15 min在 490 nm 下 用 722 分 光 光 度 计 进 行 比 色 分 析 同 法 做 空 白 样 。将 胆 固 醇 标 准 品 用 甲 醇 溶 解 配 成 1 mgmL-1 溶 液 取 不 同 体积 胆 固 醇 标 准 品 溶 液 与 样 品 做 同 样 处 理 以 胆 固 醇 浓 度 为 横坐 标 吸 光 度 值 为 纵 坐 标 制 作 工 作 曲 线 。 根 据 样 品 的 吸 光 度值 计 算 样 品 中 胆 固 醇 含 量 。1.2.3 试 剂 盒 法 样 品 前 处 理 方 法 同 1.2.
7、1 根 据 试 剂 盒 说 明 将 样 品 与工 作 液 混 合 37 保 温 5 min 后 在 波 长 500 nm 处 比 色 测 定吸 光 度 值 并 根 据 样 品 管 和 校 准 管 的 吸 光 度 值 及 校 准 品 浓 度计 算 胆 固 醇 含 量 胆 固 醇 含 量 =测 定 管 吸 光 度 值 校 准 管 吸 光 度值 校 准 品 浓 度 11.2.4 加 标 回 收 率 的 测 定 量取 0.1 gmL-1 新 鲜 蛋 黄 稀 释 液 0.5 mL 或 新 鲜 蛋 黄50 mg 加 入 1 mgmL-1 的 胆 固 醇 标 准 液 750 L 按 照 上 述3 种 方 法
8、 进 行 处 理 并 分 析 根 据 结 果 计 算 加 标 回 收 率 。 计算 公 式 见 式 回 收 率 =a-bc100%（ a 为 测 得 加 标 样 中 胆 固醇 的 量 、 b 为 样 品 中 胆 固 醇 的 量 、 c 为 加 标 量 。 ）1.3 数 据 处 理 采 用 Excel 2007 和 SPSS 16.0 统 计 软 件 进 行数 据 处 理 和 分 析 结 果 以 “平 均 值 标 准 误 ”表 示 。2 试 验 结 果2.1HPLC 法 测 定 蛋 黄 胆 固 醇 含 量 样 品 的 高 效 液 相 色 谱 图 见 附图 。 由 附 图 可 知 胆 固 醇 的
9、保 留 时 间 为 14.662 min。2.2 测 定 结 果 比 较3 种 方 法 测 定 结 果 见 附 表 。通 过 对 3 种 方 法 的 比 较 发 现 HPLC 法 的 测 定 结 果 低 于 皂化 -比 色 法 但 差 异 不 显 著 P0.05 而 试 剂 盒 法 的 测 定 结 果 较HPLC 法 高 P0.05 。4 结 论高 效 液 相 色 谱 法 测 定 蛋 黄 胆 固 醇 含 量 方 法 可 靠 、 准 确 、简 便 重 现 性 和 再 现 性 好 。 皂 化 -比 色 法 的 准 确 性 较 HPLC 法低 较 试 剂 盒 法 高 。 用 总 胆 固 醇 试 剂
10、盒 测 定 蛋 黄 胆 固 醇 含 量的 结 果 偏 高 不 建 议 使 用 血 清 总 胆 固 醇 试 剂 盒 来 测 定 蛋 黄 的胆 固 醇 含 量 。蛋 黄 中 卵 磷 脂 的 测 定自 法 国 人 从 年 从 蛋黄 和 脑 中 发 现 含 磷 的 脂 类 物 质 ， 并 于 年 命 名 为 卵磷 脂 （ ） 以 来 ， 陆 续 从 许 多 动 植 物 中 分离 、 确 认 了 许 多 磷 脂 物 质 。 年 将 磷 脂酰 胆 碱 从 其 他 磷 脂 中 分 离 出 来 。 目 前 广 义 的 ”卵 磷 脂 ”堤将 卵 磷 脂 视 作 各 种 磷 脂 的 同 义 词 ， 或 定 义 为
11、 ”丙 酮 不 溶 物 （ 即 各 种 磷 脂 ） 在 以 上 的 一 种 极 性 和 非 极 性 脂 类 的 混 合 物 ， 其 中 包 括 磷 脂 酰 胆 碱 （ ） 、 磷 脂 酰 乙 醇 胺（ ） 、 磷 脂 酰 肌 醇 （ ） 、 磷 脂 酰 丝 氨 酸 （ ） 等磷 脂 和 甘 油 三 脂 的 混 合 脂 类 ”。 市 售 的 ”卵 磷 脂 ”即 是 广 义的 卵 磷 脂 。 从 蛋 黄 中 提 取 磷 脂 ： 鸡 蛋 每 个 质 量 为 、 蛋 壳 、 蛋 清 、 蛋 黄 。 蛋 黄 由 水 分 、 蛋 白 质 、 脂 类 组 成 ， 其 中 脂 类 以 脂 蛋 白 形 式 存
12、在 。 在 脂 类 中 磷 脂占 、 中 性 脂 肪 、 胆 固 醇 。 利 用 蛋 黄 中 各成 分 在 有 机 溶 剂 中 溶 解 度 的 不 同 ， 采 用 溶 解 与 沉 淀 相 结 合的 方 法 提 取 磷 脂 。 游 离 脂 肪 及 胆 固 醇 溶 于 一 般 的 有 机 溶 剂 。磷 脂 可 溶 于 氯 仿 、 乙 醚 、 石 油 醚 、 正 己 烷 ， 不 溶 于 丙 酮 和乙 酸 乙 酯 。 蛋 黄 中 的 色 素 主 要 是 类 胡 萝 卜 素 ， 可 以 用 乙 醚 、石 油 醚 、 丙 酮 等 提 取 。 综 合 考 虑 以 上 各 因 素 ， 从 蛋 黄 中 提取 卵
13、 磷 脂 可 有 以 下 两 种 思 路 ： 新 鲜 蛋 黄 丙 酮 提 取 直 接 用乙 醇 提 取 再 用 丙 酮 沉 淀 这 种 方 法 的 操 作 因 采 用 的 原 料 而 不同 。（ ） 以 蛋 黄 粉 为 原 料 口 直 接 将 蛋 黄 粉 与 乙醇 混 合 搅 拌 ， 过 滤 后 ， 真 空 抽 去 溶 剂 ， 即 得 含 卵 磷 脂 以 上 的 磷 脂 。（ ） 以 新 鲜 蛋 黄 为 原 料 采 用 乙 醇 与 蛋 黄 一 起搅 拌 ， 过 滤 后 ， 滤 液 用 正 己 烷 苯 取 以 除 水 ， 用 饱 和 食 盐 水洗 数 遍 后 ， 浓 缩 。 以 上 两 种 方
14、法 得 到 的 磷 脂 中 ， 仍 含 有 许多 游 离 脂 肪 、 胆 固 醇 及 色 素 ， 再 用 丙 酮 或 乙 酸 乙 酯 （ 用 乙酸 乙 酯 做 沉 淀 剂 必 须 经 过 饱 和 食 盐 水 洗 过 ） 沉 淀 数 次 ， 得到 卵 磷 脂 、 脑 磷 脂 及 少 量 其 他 磷 脂 的 混 合 物 。 直 接 用 丙酮 处 理 再 用 乙 醇 抽 提 【 】 由 于 蛋 白 质 遇 丙 酮 会 变 性 而沉 淀 ， 磷 脂 均 为 丙 酮 不 溶 物 ， 除 此 之 外 蛋 黄 中 的 其 他 成分 均 较 好 的 溶 于 丙 酮 。 因 此 可 以 直 接 将 蛋 黄 粉
15、或 鲜 蛋 黄 与丙 酮 混 合 搅 拌 后 过 滤 ， 滤 液 中 含 有 大 量 杂 质 及 少 许 卵 磷 脂 ，弃 去 不 要 。 再 用 乙 醇 抽 提 出 磷 脂 。 经 实 验 比 较 ， 方 法 比方 法 的 胆 固 醇 、 游 离 脂 肪 及 色 素 脱 除 彻 底 。 通 过 试 验 并综 合 考 虑 纯 度 、 色 泽 、 状 态 以 及 成 本 等 因 素 ， 得 出 比 较 合理 的 路 线 如 下 ：- 路 线 图 -对 于 作 为 食 品 用 化 学 品 （ 或 添 加 剂 ） 的 ”卵 磷 ， 在 联合 国 的 、 美 国 的 补 充 版（ ） 、 日 本 的 公 定 书 都 有 明 确 规 定 。 这 些 测定 方 法 多 以 丙 酮 不 溶 物 、 含 磷 量 、 乙 醚 不 溶 物 等 为 指 标 ，我 们 根 据 自 身 条 件 采 用 薄 层 层 析 法 和 测 磷 法 删 磷 脂 。 （ 测 磷脂 总 量 ） 来 确 定 所 得 产 品 中 磷 脂 总 量 。 实 验 部 分 原 料 蛋 黄 粉 购 自
