《广西长寿地区人群白细胞DNA总体甲基化水平研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《广西长寿地区人群白细胞DNA总体甲基化水平研究（14页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1广西长寿地区人群白细胞 DNA 总体甲基化水平研究作者：张志勇 李春宏 仇小强 农清清 何敏 覃健 蒋贵发 黄明立【摘要 】 目的 比较广西长寿地区巴马县人群与一般地区人群的白细胞 DNA 总体甲基化水平，探讨长寿与 DNA 甲基化之间可能存在的关系。方法 (1)在巴马县长寿村落抽取健康个体 199 人组成实验组，另抽取与实验组年龄性别相匹配的个体 163 人组成对照组。(2)取研究对象外周血 2 ml，分离白细胞、提取 DNA，用高效液相色谱法检测其中胞嘧啶(dC)和 5甲基胞嘧啶 (5dmC)浓度，计算5dmC/(dC+5dmC)比值，以比值代表研究对象总体甲基化水平。结果 (1)对照组
2、和实验组研究对象的总体甲基化水平都呈增龄性下降，下降速率分别为-0.874 3 和-1.151 7，年龄与甲基化比值呈负相关，相关系数分别是-0.480 和-0.639；(2)实验组人群 DNA 总体甲基化水平比对照组的高(P0.001)；分年龄组段比较，在10、20 、40 、 50、60 年龄段，实验组人群的甲基化水平高于对照组(P0.05) 。 结论 巴马县人群长寿与其 DNA 总体甲基化水平较高可能有一定的关系。 【关键词】 巴马县；长寿；DNA 总体甲基化水平2【Abstract】Objective To compare the total methylation level of
3、the leukocytes from persons living in the longevity district Bama county of Guangxi province with from general district, and study possible relationship between the longevity and DNA methylation. Methods 199 healthy individuals in the longevity villages of Bama were selected as case group and anothe
4、r 163 healthy individuals as control group living in general district. 2 ml vein blood was obtained from the subjects to extract DNA and then detect the concentrations of the dC and 5dmC with the HPLC and calculate the value of 5dmC/(dC+5dmC) which represents the subjects total methylation level. Re
5、sults The total methylation level declined with aging in control and case groups by -0.874 3 and -1.151 7 respectively. Age was negatively correlated to 5dmC/(dC+5dmC) value (r=-0.506 2 and -0.666 6 respectively). The total methylation level of the case group was higher than that of control group(P0
6、.001). Analyzing in details, in the year of 10, 20, 40, 50 and 60，5dmC/(dC+5dmC) value in case group was higher than that of control group. Conclusions There is relationship between individuals longevity in Bama county and their higher total DNA methylation level.3【Key words】Bama County; Longevity;
7、DNA total methylation level衰老是由一系列基因激活和阻抑及其通过各自表达产物相互作用的结果。DNA 甲基化是有核细胞特有的复制后修饰，与肿瘤、遗传病、自身免疫性疾病、衰老的发生密切相关1 。研究表明多数动物的组织或器官基因组中 5甲基胞嘧啶(5dmC) 含量随年龄增加而下降2 ，Wilson 等3发现培养的人二倍体成纤维细胞中 5dmC 含量随培养代数增加而降低，说明 DNA 甲基化程度与细胞寿命有关。Golbus 等4 发现 36 岁以上组人群 T 细胞基因组中 5dmC 含量较 35 岁以下组低约 11%，且下降速度存在个体间的差异 5 。以上研究说明基因组 DN
8、A 甲基化水平降低的趋势在衰老中普遍存在的。广西巴马县是世界知名的长寿之乡，人群长寿现象自古有之，据全国第五次人口普查，全县共有百岁老人 74 名，占总人口的31/105，90 岁99 岁老人 173 人，占总人口的 75/105，本研究旨在探讨巴马县人群 DNA 总体甲基化水平，以揭示 DNA 甲基化与人类长寿之间可能存在的关系，为长寿机制的研究提供更多的线索。41 材料与方法1.1 对象用非概率抽样法在巴马县长寿村落抽取健康个体组成实验组，其年龄的判别除了身份证外，还辅予社会学调查、家系调查等；以成组匹配的方法在我校附属医院接受例行健康体检的健康人群中选择与实验组年龄性别相匹配的对象为对照
9、组。以上两组的研究对象均经常规的体格检查,患有肿瘤、自身免疫性疾病、慢性病及其他衰老相关性疾病等个体不纳入本研究范围。1.2 试剂及仪器脱氧胞苷、5 甲基脱氧胞苷、核酸酶 T1 、核酸酶 A 、核酸酶 P1 等试剂购自 Sigma 公司；所用溶液包括 30 mmol/L pH5.2 醋酸钠溶液、20 mmol/L 硫酸锌溶液、20 mmol/L pH4.1磷酸氢二铵溶液、10%(v/v)甲醇溶液、40%(v/v)甲醇溶液、四氢呋喃溶液。所用仪器有电子天平、pH 计、日本岛津 150 mm C18 柱、预柱、日本岛津高效液相色谱仪、紫外检测器等。1.3 方法51.3.1 标本采集与 DNA 提取
10、在签订知情同意书的前提下，抽取实验对象外周静脉血 2 ml，分离白细胞并提取 DNA6 。1.3.2 DNA 的预处理和水解取 DNA 约 30 g 经酶解、沉淀、洗涤、离心等步骤，溶液转存于-20 中,待测。1.4 高效液相色谱法检测 DNA 总体甲基化水平1.4.1 标准溶液的配制和标准方程的建立首先配制标准品 dC 和 5dmC 的标准溶液，dC：1、5 、 10、50、100 mol/L，5dmC ：0.05、0.25、0.5、2.5、5 mol/L。然后分别进样 5 个不同浓度梯度的标准溶液 ,根据峰面积 浓度分别建立 dC和 5dmC 二元一次方程 dC：Y=2.23X10-4-0
11、.675；5dmC ：Y=2.72 X10-4-0.369；其中 Y：物质的摩尔浓度，X:峰面积。两相关系数的显著性检验 P 均0.001。并计算各自的相关系数 r 值分别为 0.999 933，0.999 196。61.4.2 高效液相法检测样品通过进样检测样品，获取每个样品中 dC 和 5dmC 的峰面积，利用标准方程计算其对应的浓度，最后以物质浓度计算每个样品中 5dmC/(dC+5dmC)的比值，以此比值代表每个个体的总体甲基化水平。1.4.3 实验条件的选择和优化经比较分析，选择 279 nm 的紫外光为固定检测波长，确定含 0.6%四氢呋喃的 20 mmol/L pH 4.1 磷酸
12、氢二铵溶液为最佳的流动相。日内精密度 CV5% ；日间精密度 CV1.6%；dC 回收率分别是 94.5%、 96.7%和 103.5%，5dmC 的回收率分别是90.4%、97.2%和 103.7%。以上数据表明，实验条件的重复性和稳定性较好。与标准品的峰型(见图 1A)比较，空白对照和阴性对照的图谱中均无目标峰型出现,表明被测样品溶液中除了待测组份，没有其他对目标组分产生干扰的物质存在。检测待测样品时，色谱图(见图 1B)中出现了目标组份和其他物质的峰型，各峰之间没有干扰。从以上标准品色谱图可知，dC 和 5dmC 的保留时间分别是3.70 分钟和 6.05 min，通过与标准品色谱图相比
13、较可知，在样品色7谱图中，保留时间为 3.68 min 和 6.00 min 的色谱峰分别是样品DNA 水解产物中 dC 和 5dmC 的峰型，以此对比达到对待测物质进行定性的目的。1.5 统计学处理用 SPSS13.0 软件统计分析对照组与实验组中5dmC/(dC+5dmC)比值的差异, 以反映两组中 DNA 甲基化程度。2 结果2.1 研究对象一般情况分析本研究的实验对象共 362 名,对照组 163 名,其中男 84 人，女 79 人，男女构成比分别是 51.5%和 48.5%,年龄 1696 岁；实验组 199 名 ,其中男 100 人,女 99 人，男女构成比分别是 49.6%和50
14、.4%,年龄 4110 岁。两组实验对象间性别分布无统计学差异(P 0.05),两组间具有可比性。对照组与实验组各以 10 岁为一年龄组划分,每个年龄段内的研究对象平均年龄无统计学差异(P0.05),两组间各年龄组段的甲基化比值具有可比性。2.2 两组甲基化比值比较82.2.1 两组总体甲基化水平比较由于年龄与甲基化比值之间呈负相关的关系，要比较对照组与实验组总体甲基化水平有无差别，必须消除年龄对甲基化比值的影响。以年龄为协变量，对两组的甲基化比值作协变量方差分析，对照组与实验组的甲基化比值分别为 0.038 60.004 5、0.039 40.004 5，组间比较差异有统计学意义(F=29.
15、48，P0.001)，即总体而言，实验组的 DNA 甲基化水平高于对照组。表 1 两组人群各年龄段的甲基化比值(略)2.2.2 性别间甲基化比值的比较无论是对照组还是实验组，男女间甲基化比值无统计学差异。2.2.3 两组各年龄段甲基化比值的相互比较在已知总体上两组的甲基化水平有差别的基础上，进一步详细分析各年龄组段的甲基化水平是否存在差异。在对照组或实验组内不同年龄段间，甲基化比值有统计学差异，对照组与实验组间同一年龄段内比较发现：10、20、40、50 、60年龄段间9实验组(P0.05) 甲基化比值较高。其他各年龄段内的对照组和实验组的甲基化比值差别无统计学意义(见表 1)。分别建立对照组
16、和实验组的年龄 甲基化比值回归方程显示，年龄与甲基化比值呈负相关关系，对照组与实验组的相关系数分别是-0.480 和-0.639( 见图 2)。两方程的斜率即对照组和实验组的 DNA 总体甲基化水平随年龄下降的速度为-0.874 3 和-1.151 7。3 讨 论3.1 DNA 总体甲基化水平随年龄的增长而发生改变据以往文献报导,无论是动物,还是人类,随着年龄的增长,DNA总体甲基化水平会逐渐下降。尹慧等7分析人外周血白细胞中的基因组 5dmC 含量与年龄之间的关系，发现 50 岁以上组的5dmC 含量较 50 岁以下组低，随年龄以 0.014%/年的量下降。本研究结 JS 也符合以上变化规律, 对照组与实验组人群的总体 DNA甲基化水平都发生了增龄性降低。以 10 岁为一个年龄段划分研究对象后做统计学分析，不同年龄段的平均甲基化比值均
