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1、病原性球菌检查（二）实验目的 1 掌握病原性球菌培养物性状。 2 掌握血浆凝固酶试验原理方法。 3 掌握密集接种法，熟悉药物（如抗生素）抑菌杀菌原理并了解纸片法、试管法的试验方法及应用。 实验材料 1、菌种：金黄色葡萄球菌、痢疾杆菌 68 小时肉汤培养物。 2、培养基：普通琼脂平板、肉汤培养基。 3、药品：青霉素溶液（50u/ml）、抗生素滤纸片。 4、器具：恒温箱、接种环、酒精灯、试管、无菌棉拭、无菌小镊子、无菌吸管、玻片、血浆。 实验内容 一、病原性球菌的培养物观察 肉眼观察葡萄球菌、链球菌、肺炎球菌在血琼脂平板上的生长情况及脑膜炎球菌在巧克力（色）琼脂平板上的生长情况，比较菌落的形态特征
2、。 （1）葡萄球菌：在血琼脂平板上培养 1824 小时，形成圆表凸起，表面光滑、湿润、边缘整齐，菌落不透明。金黄色葡萄球菌金黄色，可产生透明溶血环；表皮葡萄球菌白色、无溶血环，腐生葡萄球菌白色或柠檬色，无溶血环。 （2）链球菌：在血琼脂平板上培养 1824 小时，形成灰白色、圆形凸起、半透明或不透明的细小菌落。甲型溶血性链球菌不完全溶血，在菌落周围形成草绿色溶血环，乙型溶血性链球菌完全溶血、形成透明溶血环，丙型链球菌不发生形成圆形、光滑隆起透明似露珠的菌落。在血琼脂平板上不发生溶血溶血、无溶血环。 （3）肺炎球菌：血琼脂平板上培养 1824 小时，形成细小、灰白色、扁平、半透明的菌落，周围有草
3、绿色溶血环，其与甲型溶血性链球菌相似，培养 23 天后，因菌体发生自溶，菌落中央下陷呈“脐状”。 （4）脑膜炎球菌：在巧克力（色）琼脂平板上加 5%CO237培养 24 小时， 形成圆形光滑隆起透明似露珠的菌落，无溶血环。 二、血浆凝固酶试验 1、原理 致病性葡萄球菌能产生血浆凝固酶，使人或动物血浆发生凝固，因此，测定血浆凝固酶的有无是鉴定葡萄球菌致病性的重要依据。 2、方法及结果 （1） 玻片法： 取干净玻片一块，用记号笔将玻片划成两格，其中一格加 2 接种环的生理盐水，另一格加 1：2 人血浆（或免血浆）1 接种环。 用接种环取上次培养物葡萄球菌之菌落少许在生理盐水内研磨成细菌悬液，然后取
4、此悬液 1 环与血浆混匀。 5 分钟以内观察结果，若有凝块出现，即为阳性；若无凝块出现，则为阴性。（2） 试管法： 按表 24-1 加入 1：4 血浆及葡萄球菌肉汤培养液。 将各管置 37水浴中，每隔 30 分钟观察一次结果。 在 3 小时内，若第一管及第二管出现凝固，而第三管不出现凝固则为阳性。 表 24-1 血浆凝固酶试验（试管法）试管 血浆（1：4） 待检葡萄球菌肉 汤培养物 金黄色葡萄球菌 肉汤培养物 肉汤 结果1 0.5ml 0.5ml 2 0.5ml 0.5ml 3 0.5ml 0.5ml1 病原性球菌检查（二）三、药物敏感性试验实验原理 治疗细菌感染的药物如磺胺类、异烟肼、抗生素
5、等杀菌具有抑菌和杀菌作用，其作用机制主要是干扰细菌的代谢，阻碍和影响细菌细胞壁的合成、膜的通透性及核酸和蛋白质的生物合成，不同的细菌种类或菌株，对同一药物的敏感性不同，因此测定病原菌对抗菌类药物的敏感性，对于合理用药和提高临床疗效具有重要意义。本实验通过两种方法测定细菌对抗生素的敏感程序。内容与方法一、纸片法1、密集接种法接种细菌：用无菌接种环挑取已培养好的金黄色葡萄球菌培养物少许，先在平板琼脂表面中央划一条线，垂直该线作平行密集划线，划满平板。再将平板转动 90 度，作平行密集划线，划满平板。2、用无菌注射针头挑取抗生素（青霉素、链霉素、红霉素、庆大霉素、卡那霉素等）滤纸片，贴在平板琼脂表面
6、。滤纸片之间距离应基本相等，一般每个平板贴四到五个滤纸片为宜。注意每次取滤纸片之前，针头须烧灼灭菌冷却。3、将平板置 37温箱培养 24 小时后取出观察滤纸片周围的抑菌圈（见图201），用尺子测量其直径并对照细菌对抗生素敏感度判断表做出结果判断。二、试管法1、金黄色葡萄球菌菌液制备取金黄色葡萄球菌 68 小时肉汤培养物 0.1ml 加于 2ml 肉汤培养基中，置 37温箱培养 68 小时后备用。2、方法（1）取 10 支无菌小试管标号后，除第一管外其它每管加入肉汤培养基 1ml。（2）在第一、二管中各加入青霉素（50u/ml）溶液 1ml，混匀。（3）从第二管中吸取 1ml 加入第三管中，混匀，然后依此法加样稀释至第九管，再从第九管中抽取 1ml 弃去。第十管不加青霉素作为对照管。（4）于每管中加入金黄色葡萄球菌菌液各 0.1ml，混匀。（5）置 37温箱培养 24 小时后观察结果，以培养基混浊程度来判断细菌对青霉素的敏感程度，最高稀释度的抗菌药物仍能抑制细菌生长者为最低抑菌浓度（MIC）可用单位/ml 表示之。 常用药敏试验纸片判断标准与其相应的 MIC 近似值
