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1、1密码子优化 HPV16 衣壳基因真核共表达载体的构建及细胞转染【摘要】 目的: 构建密码子优化的 HPV16 衣壳基因真核共表达载体 pcDNA3.1L1IRESL2。方法: 用 PCR 技术从 988 载体中获得 L1IRESL2 片段, 将该片段克隆到 pCRXLTOPO载体, 然后定向亚克隆到 pcDNA3.1(+)真核表达载体中, 从而构建真核共表达载体 pcDNA3.1L1IRESL2; 通过水动力转染技术(hydrodynamicsbased transfection)和脂质体细胞转染法(liposomemediated transfection of cells), 检测衣壳基
2、因的体内、 外转录情况 ; 重组质粒转染后 293T 细胞后观察其形态变化, 用 Western blot 方法检测 293T 细胞中 L1 衣壳蛋白的表达。结果: 酶切和测序结果表明真核共表达载体 pcDNA3.1L1IRESL2 构建正确。重组质粒中的 L1 和 L2 基因在小鼠肝脏、 293T 细胞中均发生转录。重组质粒转染 293T 细胞后出现 CPE（cytopathic effect）现象, 表明衣壳基因在细胞中已表达。Western blot 方法检测发现 L1 蛋白在 293T 细胞中表达。结论: 成功地构建了pcDNA3.1L1IRESL2 共表达真核载体, 为进一步研究 H
3、PV16感染机制奠定基础。 【关键词】 密码子优化 衣壳基因 共表达真核载体 细胞转染2人乳头瘤病毒(human papillomavirus, HPV)属乳多空病毒科, 具有上皮细胞嗜性。迄今为止, 已分离到的基因型有 100 种以上1, 2 。根据各型病毒的潜在致病性可将 HPV 分为低危型和高危型两类, 大量研究证实高危型中的 16、 18 型与宫颈癌的发生密切相关, 其中又以 HPV16 型最为常见。宫颈癌是全世界仅次于乳腺癌致妇女死亡的第二大癌症, 据报道全球每年大约有 50 万宫颈癌新发病例, 约 25 万人死于该癌症3 。因为乳头瘤病毒的增殖与上皮细胞的分化紧密相连, 所以一直以
4、来感染性乳头瘤病毒只能通过烦琐的器官培养（organotypic cultures）和小鼠异种移植（ mouse xenografts）途径获得, 而用这两种方法很难获得足量的野生型或突变型 HPV 颗粒, 这大大限制了乳头瘤病毒生物学许多方面的研究4-6 。最近 Pyeon7 、 Culp8采用假病毒技术建立了用于病毒培养的瞬时转染系统, 该系统中每个细胞能产生大量有感染性的病毒, 病毒产生量是常规器官培养的 1000 倍之多。Pyeon 的研究表明, 该瞬时转染系统要求密码子优化的 L1 与 L2 基因必须同时转染细胞, 而单独 L1 基因或 L2 基因都不会使该系统发挥作用。Pyeon
5、采用的是 pcDNAHPV16L1 和 pcDNAHPV16L2 两种质粒进行共转染, 而本研究中, 我们构建的是密码子优化的 HPV16 衣壳基因真核共表达载体即 pcDNA3.1L1IRESL2, 通过连接子IRES 实现了 L1 和 L2 基因在一个载体中的共表达 , 无需同时转染两个质粒, 可大大简化实验操作。31 材料和方法1.1 材料 988 质粒（德国科学家 Martin Mueller 惠赠）, pcDNA3.1(+)载体（本实验室库存）; 细胞株: 293T 细胞（中国农业科学院哈尔滨兽研所惠赠）; LA Taq DNA 聚合酶和反转录试剂盒（购自 fermentas 公司）
6、 ; 质粒提取和胶回收试剂盒（购自AXYGEN 公司）; TOPOXL PCR克隆试剂盒及LipofecamineTM2000（购自 Invitrogen 公司）; 电转化感受态Top10 菌（购自 TaKaRa 公司）; HPV16 L1 单克隆抗体(mAb)（购自上海吉泰新择生物科技有限公司）; 辣根过氧化物 (HRP)标记的羊抗鼠 IgG（购自北京博奥森生物技术有限公司）; 其他试剂均为国产分析纯; 昆明白雌性小鼠（68 周龄, 质量 1822 g）购自新疆医科大学动物实验中心。1.2 方法1.2.1 引物设计 根据 pcDNA3.1(+)载体和德国科学家Martin Mueller 提
7、供的密码子优化的 HPV16 L1、 L2 基因序列设计 5 条引物, 具体序列见表 1。表 1 引物设计（略）4Tab 1 Primer design1.2.2 密码子优化的 pcDNA3.1L1IRESL2 重组质粒的构建 构建策略: 以 988 质粒为模板扩增 L1IRESL2 基因片段, 将该片段构建到 pCRXLTOPO载体上, 然后定向亚克隆到pcDNA3.1(+)真核表达载体中。目的基因的获取: 以 988 质粒为模板, 以 HPVHL1L2P1/HPVHL1L2P2 为引物, 在 LA DNA聚合酶作用下, 94预变性 5 min, 94变性 45 s, 67 退火 45 s,
8、 68延伸 4.5 min, 共 30 个循环, 68延伸 30 min, 合成L1IRESL2 基因。10 g/L 琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 扩增结果。pCRXLTOPOL1IRESL2 的构建: 琼脂糖凝胶电泳检测PCR 产物, 切胶回收并纯化 L1IRESL2 片段。按照 TOPOXL PCR 克隆试剂盒说明书, 构建 pCRXLTOPOL1IRESL2。电泳检测 EcoR I、 Xho I 和 Sfi I 酶切产物。pcDNA3.1L1IRESL2 重组质粒的构建与鉴定: 用 EcoR I、 Xho I 和 Sfi I 酶切 pCRXLTOPOL1IRESL2 质粒, 回收纯化 L1
9、IRESL2 片段。T4 DNA 连接酶连接 L1IRESL2 基因片段与双酶切后的 pcDNA3.1 载体, 16过夜。用电转化法转化感受态Top10 菌株（电压 2500 V, 电阻 200 , 电容 25 F）, 37摇床孵育 1 h 后涂布含氨苄青霉素的 LB 选择平板, 37过夜。次日随机挑取阳性菌落, 碱裂解法小量提取质粒。 EcoR I 及 Xho I 双酶切, 琼脂糖电泳鉴定正确后送往上海生工测序。51.2.3 小鼠肝脏中 pcDNA3.1L1IRESL2 重组质粒表达情况的检测 将等量的空 pCDNA3.1 载体和 pcDNA3.1L1IRESL2重组质粒（均为 10 g）分
10、别溶于 2.5 mL 灭菌生理盐水中。采用以流体力学为基础的大容量快速尾静脉注射法（hydrodynamicsbased transfection method, HD)在 7 s 内注入小鼠尾静脉中9, 10 。每组 2 只小鼠, 注射后 8 h 处死, 取肝脏, 按照 Invitrogen trizol 说明书提取总 RNA, 按照 fermentas 公司反转录试剂盒要求合成 cDNA。利用 L1 基因、 L2 基因特异性引物检测这两种基因在小鼠肝脏中的表达情况。1.2.4 293T 细胞中 pcDNA3.1L1IRESL2 重组质粒表达情况的检测 选取对数生长期的 293T 细胞进行转
11、染实验,转染步骤按Invitrogen 公司提供的 293T 转染细胞的实验流程操作。空pCDNA3.1 载体作为对照组, pcDNA3.1L1IRESL2 重组质粒为实验组。培养 48 h 后, 观察细胞形态变化并按照步骤 1.2.3 的方法提取 RNA, 检测 L1 基因、 L2 基因的表达情况。同时用 TRIzol 法提取细胞总蛋白, Western blot 进行检测, 一抗为 L1 mAb, 二抗为山羊抗小鼠 HRP。2 结果62.1 目的基因的克隆 对 PCR 扩增产物进行 10 g/L 琼脂糖凝胶电泳, 在约 3600 bp 处出现清晰的条带(图 1)。与预计目的片段大小(362
12、5 bp)相符。图 1 L1IRESL2 PCR 琼脂糖凝胶电泳结果（略）Fig 1 Agrose gel electrophoresis assay for PCR result of L1IRESL2 fragmentM: DL 15000+2000 marker; 1: PCR fragment of L1IRESL2.2.2 pCRXLTOPOL1IRESL2 的构建 用限制性内切酶 EcoR I、 Xho I 和 Sfi I 酶切 pCRXLTOPOL1IRESL2, 琼脂糖凝胶电泳检测结果表明 pCRXLTOPOL1IRESL2 构建成功（图 2） 。图 2 pCRXLTOPOL1
13、IRESL2 质粒酶切鉴定（略）Fig 2 pCRXLTOPOL1IRESL2 plasmid identified by restriction enzyme digestion7M: DL 15000+2000 marker; 1: pCRXLTOPO vector; 2: pCRXLTOPOL1IRESL2 plasmid digested by EcoR I, Xho I and Sfi I.2.3 pcDNA3.1L1IRESL2 重组质粒构建与鉴定 通过EcoR I、 Xho I 和 Sfi I 酶切 pCRXLTOPOL1IRESL2 获得 L1IRESL2 基因片段, 定向亚克
14、隆至经 EcoR I 和 Xho I 双酶切的 pcDNA3.1 载体中 , 构建得到 pcDNA3.1L1IRESL2 重组载体。用 EcoR I 和 Xho I 双酶切鉴定并测序, 结果证实pcDNA3.1L1IRESL2 重组质粒构建正确:目的基因序列没有发生变异且插入方向正确（图 3） 。图 3 pcDNA3.1L1IRESL2 质粒酶切鉴定（略）Fig 3 Identification of pcDNA3.1L1IRESL2 plasmid by restriction enzyme digestionM: DL 15000+2000 marker; 1: pcDNA3.1 vect
15、or; 2: pcDNA3.1L1IRESL2 plasmid digested by EcoR I and Xho I.2.4 重组质粒在小鼠肝脏中的瞬时表达 RTPCR 结果表明, 尾静脉注射 pcDNA3.1L1IRESL2 重组质粒后, 密码子优化的HPV 16 L1、 L2 基因均在小鼠肝脏中表达, 尾静脉注射8pcDNA3.1（+ ）空质粒的小鼠肝脏中则未检测到有 L1、 L2 基因表达（图 4、 5） 。2.5 转染后 293T 细胞的形态观察及 pcDNA3.1L1IRESL2 重组质粒表达情况的检测 2.5.1 形态观察 倒置显微镜观察发现实验组细胞与对照组细胞在形态学上发生明显变化, 对照组细胞的触角正常 , 贴壁能力较好; 而实验组细胞明显变圆, 形态类似葡萄呈串状排列 , 贴壁能力下降, 部分悬浮（图 6） 。图 4 注射 pcDNA3.1L1IRESL2 质粒后小鼠肝脏中 L1基因的表达检测（略）Fig 4 Results of L1 gene expressed in mouse liver after pcDNA3.1L1IRESL2 injectionM: DL 2000 marker; 1: Negative control; 2:
