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1、1家蝇相关序列扩增多态性扩增体系的建立与优化作者：刘红美, 方小波, 郑勤妮, 胡仕明, 吴建伟【摘要 】 目的： 建立和优化家蝇的相关序列扩增多态性（SRAP-PCR）扩增体系。方法: 以驯养家蝇为材料,通过单因子实验分别研究了模板 DNA、Mg2+、dNTPs 、引物浓度及 Taq DNA聚合酶用量对家蝇 SRAP 分子标记扩增体系的影响, 并对扩增体系进行了优化。结果: 优化后的反应体系总体积为 30 l,含 50 ng 模板DNA、1.5 mmol/ L Mg2+、0. 20 mmol/ L dNTPs、0. 15 mol/ L 引物和 0. 50 U Taq DNA 聚合酶。结论:
2、家蝇 SRAP-PCR扩增优化系统的建立,为今后利用 SRAP 技术进行家蝇遗传多样性分析、基因定位奠定了基础。 【关键词】 蝇科; 随机扩增多态 DNA 技术； 遗传标记Abstract Objective: To establish and optimize SRAP-PCR reaction system of housefly. Methods: Effects of concentrations of template DNA, Mg2+, dNTPs, primers and amount of Taq DNA polymerase on SRAP molecular marker
3、 amplification system of Musca domestica L were studied in monofactorial experiment, and the amplification system was 2optimized. Results: Total volume of the optimal system was 30l containing 50 ng of template DNA, 1.5mmol/ L of Mg2+, 0. 20 mmol/ L of dNTPs, 0. 15mol/ L of primers and 0. 50 U of Ta
4、q DNA polymerase. Conclusion: This system provides a useful tool for analysis of genetic diversity and gene location of Musca domestica L.Key words Muscidae; random amplified polymorphic DNA technique; genetic markers家蝇 ( Musca domestica L )是重要的医学媒介昆虫, 能传播痢疾、伤寒、霍乱、脊髓灰质炎等多种疾病。近年来,随着家蝇体内抗菌肽的发现,家蝇在工业原料
5、、医药保健和自然界物质能量循环等方面具有重要的应用价值。由于对家蝇的偏见,国内外从分子水平研究家蝇的报道还比较少,并且都只限于 RAPD 技术的利用1。相关序列扩增多态性(Sequence-related amplified polymorphism,SRAP) 是一种基于 PCR 原理的新型 DNA 分子标记技术,其技术的核心是PCR 扩增,影响 PCR 扩增的因素都将影响到 SRAP 的成败。因此,对Taq 酶、Mg2+、模板 DNA、dNTPs、引物这 5 个因子进行优化,建立适合家蝇 DNA 的 SRAP-PCR 扩增体系,为 SRAP 系统在家蝇乃至昆虫中的研究鉴定基础。31 材料与
6、方法1.1 材料1.1.1 供试材料驯化家蝇由贵阳医学院寄生虫学教研室 2000 年建立种群,并在实验室进行多代种群繁殖。幼虫以麦麸、蛆浆、面粉和水混合物为饲料,饲养温度（ 251）,相对湿度为 50%60%,光照 12 h。实验时选用肥大的 3 龄幼虫作为材料。1.1.2 仪器、试剂实验用 PCR 扩增仪为 Eppendorf 5331 梯度 PCR 仪; 10 PCR buffer、MgCl2、dNTPs 、Taq DNA 聚合酶、琼脂糖和DL2000(Marker)等均购自大连 Takara (宝生物)工程有限公司。SRAP 引物由上海鼎安生物科技有限公司合成, 引物名称及序列见表1。表
7、 1 SRAP 引物及序列（略）1.2 方法1.2.1 家蝇基因组 DNA 的提取4采用徐书华等2人的方法，提取家蝇 3 龄幼虫基因组DNA,DNA 经紫外分光光度计和 0.8 %琼脂糖凝胶电泳检测和定量 ,将纯度好、杂质少的样品于-20 保存用于 PCR 扩增。1.2.2 PCR 体系、程序及检测参照 Li 等3的扩增反应体系。标准 PCR 反应体系中模板DNA 100 ng,dNTPs 0.2 mmol/L,上下游引物 0.2 mol/L,1.5 mmol/L MgCl2, 1U Taq 酶,总体积为 30 l。扩增程序采用复性变温法：开始 95 变性 2min,反应前 5 个循环在 94
8、 1 min,35 1 min,72 2 min 条件下运行；之后 35 个循环为 94 1 min,50 1 min,72 2 min；最后 72 延伸 7 min。2%琼脂糖凝胶电泳检测,电极缓冲液采用 0.5TBE,稳电压 80 V,30 min。溴化乙锭染色, 凝胶成像系统观察并拍照。1.2.3 SRAP 引物筛选用 1.2.2 项下获得的 SRAP-PCR 扩增体系和扩增程序进行表1 中正向引物间的组合、反向引物间组合和正反向引物组合的筛选,将扩增效果好、条带多、重复性好的引物组合用于扩增体系的优化。51.2.4 SRAP-PCR 扩增反应体系的优化以家蝇基因组 DNA 为模板,对
9、SRAP-PCR 扩增反应 5 大影响因子进行 5 水平单因素梯度设置, 见表 2。表 2 家蝇 SRAP-PCR扩增反应各影响因子的梯度设置（略）2 结果2.1 SRAP 引物筛选为检测所设计引物（表 1）的质量和对雌、雄家蝇基因组DNA 的扩增效果 ,将表 1 的 5 个正向引物、6 个反向引物进行组间与组内的引物组合进行筛选,用琼脂糖凝胶电泳检测各引物组合的扩增效果（见图 1） 。表 3 为扩增效果好的引物组合。实验共筛选 21对扩增效果好的引物组合。正向引物组合扩增效果好的有 3 对，6个反向引物组合扩增效果好的有 9 对，其余 9 对为正向引物与反向引物间的组合。结果显示,所设计的
10、SRAP 引物不但可以正向和反向引物间配对组合,而且正向引物间、反向引物间也可以组合配对进行PCR 扩增。2.2 家蝇模板 DNA 浓度优化 PCR 扩增反应中, 模板量的过多或过少都将影响扩增的效率。模板量过少时,扩增效率低,模6板和引物不能有效配对,无扩增带或扩增带较少；当量过多时,出现弥散状背景而且无扩增产物。由图 1 可见 ,模板 10200 ng 时均有扩增条带,说明 SRAP-PCR 体系对模板量的多少要求不高。当模板 DNA 加入量为 10 ng 时 ,扩增条带很微弱,在 100 ng 以上时又开始出现弥散状背景。模板 DNA 量为 50 ng 时效果最好，见图 2。2.3 Mg
11、2+浓度 Mg2+浓度不仅影响酶活性,而且影响引物的退火、模板和中间产物的解离温度、产物的特异性、引物二聚体的形成等,因此 Mg2+的浓度对扩增反应有着显著影响。浓度过低, 无扩增产物; 浓度过高时,易产生非特异扩增,出现弥散状背景。Mg2+浓度在 1.5 mmol/L 扩增效果（亮度和丰度）较其它浓度好，见图 3。表 3 家蝇 SRAP 引物筛选结果（略）2.4 Taq 酶浓度 Taq DNA 聚合酶在 PCR 中的用量受反应体积、酶活性、酶耐热性等因素的影响。Taq 酶用量少易导致 PCR反应效率下降,造成扩增产物较少。而使用较高浓度的 Taq 酶易导致非特异性的扩增,出现弥散状背景, 不
12、见扩增条带，还造成药品浪费,增加成本。由图 4 可见,在 30 l 的反应体系中,Taq 酶的用量最好是0.51.0 U,超过 1.5 U,就会出现弥散状背景,不见扩增条带。所以从经济方面考虑,30 l 反应体系中 Taq 酶适宜用量为 0. 5 U。72.5 dNTPs 浓度 dNTPs 是 PCR 扩增反应的原料,必须达到一定浓度才能满足 PCR 扩增需求。若 dNTPs 浓度过低,会影响反应效率,甚至会因 dNTPs 过早的消耗而使 PCR 扩增产物单链化,影响 PCR 扩增的效果;但过高也会与 Taq DNA 聚合酶竞争 Mg2+,导致聚合酶错误的掺入,同样也不利于 PCR 扩增。由图
13、 5 可见,不同浓度 dNTPs 扩增结果差异很大。在 0.050.10mmol/ L 时扩增产物谱带很弱,在 0.15 和 0.20mmol/ L 时扩增效果较好,在 0.30 mmol/L 未见扩增条带。从扩增亮度考虑,dNTPs 的浓度确定为0.20mmol/ L。2.6 引物浓度引物的浓度会影响特异性。最佳的引物浓度一般在 0.10.5mol/L。引物量太低, 则产物量降低,甚至没有扩增产物；引物浓度过高会促进引物的错误引导非特异产物合成,还会增加引物二聚体的形成。非特异产物和引物二聚体也是 PCR 反应的底物,与靶序列竞争 DNA 聚合酶及 dNTP 底物,从而使靶序列的扩增量降低。
14、从图 6 可见,引物浓度为 0. 15 mol/L 和 0.25 mol/L 时,扩增产物电泳谱带清晰稳定，考虑到药品用量以及引物量过大易形成引物二聚体,所以确定引物浓度为 0. 15 mol/L。3 讨论8SRAP 标记是在总结已有的 DNA 分子标记优缺点的基础上开发的一种新的基于 PCR 的 DNA 分子标记技术。SRAP 标记克服了随机扩增多态 DNA（RAPD）重复性、稳定性差的缺点；不需要像限制性片段长度多态性（RFLP）标记那样要求高纯度和高浓度的 DNA 和使用放射性同位素, 也不需像扩增片断长度多态性（AFLP）那样需要预扩增和连接等烦琐的操作,从而减少了对人力、物力的需求和
15、依赖。重要的是,通过 SRAP 具有简单、高效、高共显性、重复性好、易测序等优点,尤其它可以检测基因的可译读码框(ORFs) 区域,从而提高了扩增结果与表现型的相关性4。目前,DNA分子标记技术应用于家蝇的主要是 RAPD，本实验将 SRAP 技术应用到家蝇的研究中,为在分子领域研究家蝇遗传变异提供了可能性。 实验证明，使用高浓度的琼脂糖凝胶电泳也可以较好的分辨出多态性条带,避免了使用繁琐的聚丙烯酰胺胶电泳来检测 PCR 产物。实验发现酶浓度和 Mg2+对 SRAP-PCR 扩增结果影响较大,微小的变动就能引起很大的变化，与关桦楠等5人的研究结果不同的是该体系对模板浓度的要求不高,因此有必要针
16、对不同的物种来进行 SRAP-PCR 扩增体系的优化。引物、dNTPs 浓度的变动对体系影响相对较小, 体系中各组分的浓度还可根据具体的实验情况进行调整。实验结果提示,家蝇 SRAP-PCR 适宜的反应体系为：在 30 l 反应体系中含 50 ng 模板 DNA、1.5 mmol/L Mg2+、0.20 mmol/L dNTPs、0.15 mol/L 引物和 0.50 U Taq DNA 聚合酶。9【参考文献】1 王亚超, 白林, 侯蓉. 分子标记技术在蝇类研究中的应用J.四川动物,2006(3): 658-661.2徐书华,曾庆韬 . 果蝇基因组 DNA 的大规模提取及其RAPD - PCR 反应条件的优化J. 湖北大学学报( 自然科学版), 2002(4):342-346.3Li G, Quiros C F. S
