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1、1实时荧光定量 PCR 检测金黄色葡萄球菌 femA 表达水平【摘要】 目的 探讨实时荧光定量 PCR 检测金黄色葡萄球菌 femA表达的方法。方法 以 BB270femA 基因表达为标准，建立实时荧光定量 PCR 方法，对实验菌株 femA 表达进行相对定量。结果 建立的实时荧光定量 PCR 方法所得结果标准曲线线性关系好，熔解峰单一。随 MIC 变化，金黄色葡萄球菌 femA 表达水平也随之变化。结论 用实时荧光定量 PCR 方法研究金黄色葡萄球菌 femA 表达量结果可靠、敏感、重复性好。 【关键词】 金黄色葡萄球菌；femA 基因；实时荧光定量 PCRAbstract： Objecti
2、ve To establish the approach of real-time fluorescent quantitative PCR to detect femA gene in Staphylococcus aureus strains. Methods Real-time fluorescent quantitative PCR was performed to quantify the expression of femA gene of 15 clinical stains, as compared with BB270. Results The standard curve
3、by real-time fluorescent quantitative PCR showed good linearity between the amount of femA RNA and cycle threshold and the melting curve had a single peak. The variation of expression level of femA was in 2accordance with MIC of strains. Conclusions The real-time fluorescent quantitative PCR in the
4、detection of femA expression is accurate, sensitive and repeatable.Key words: Staphylococcus aureus; femA gene; real-time fluorescent quantitative PCR实时荧光定量 PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，real-time Q-PCR）由于其具有特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快等优点，目前已经被广泛应用于基础科学研究、临床诊断、疾病研究及药物研发等领域中，其中最主要的应用集中在以下几个
5、方面：DNA 或 RNA 的绝对/相对定量分析，基因表达差异分析，基因分型。耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA ）是全球感染性疾病领域研究热点之一。已知 femA 是 MRSA 耐药表达的重要辅助基因，与 MRSA高水平耐药成正相关1-3 ，但还未见研究报道两者确切关系。本实验利用近年来兴起的实时荧光定量 PCR 检测金黄色葡萄球菌femA 基因表达水平，进一步明确 femA 在 MRSA 耐药表达中的意义。同时建立实时荧光定量 PCR 用于金黄色葡萄球菌 RNA 定量检测的具体方法和稳定体系。31 材料
6、和方法1.1 菌株和生长条件 我院微生物室从临床送检标本中分离鉴定所得金黄色葡萄球菌，选取 MSSA 4 株，低耐 MRSA 4 株，高耐MRSA 7 株。 1 株瑞士捐赠株：BB2701 。上述金黄色葡萄球菌在 M-H 培养基复苏 16 h，挑取菌落置于M-H 肉汤中在 37震荡培养，测量 D600nm，10 倍稀释 10 个浓度，取 50 l 菌液过夜孵育，选取菌落数在 100300 之间的稀释倍数计算活菌数。1.2 最低抑菌浓度（MIC）测定 以琼脂平皿对倍稀释法测定苯唑西林对 16 株菌的 MIC 值，以 ATCC 25923 为质控株，结果判定参照 CLSI2006 常规标准。1.3
7、 RNA 提取、纯化、逆转录 采用 RNA 提取纯化试剂盒（上海华舜生物工程有限公司） ，操作按说明书进行。提取前菌液中加入溶葡萄球菌素（16 U/ml，上海生工生物工程有限公司） 。测D260nm 以及 D260/D280，取 D260/D280 比值1.8 者继续下一步试验。采用 RT-PCR 试剂盒（TaKaRa 生物工程大连有限公司） ，操作按照说明书进行。反转录反应：42，15 min，95 ，42 min。1.4 real time Q-PCR 引物及方案 内参参考文献4-10选用组成型表达基因 gyrB，目的、内参基因引物用 OLIGO 3.0 设计，用 BLAST 检验引物的特
8、异性，由 TaKaRa 生物工程（大连）有限公司合成，具体见表 1。采用 real-time Q-PCR 试剂盒SYBR PrimeScript PCR kit for perfect real time，TaKaRa 生物工程（大连）有限公司 ，按说明书进行操作。步骤 1 预变性 95 10 s；步骤 2 两步法扩增 95 5 s，60 20 s，40 个循环；步骤 3 熔解曲线 95 0 s，65 15 s，95 0 s。每个反应管均设置复管，重复试验 2 次。表 1 荧光定量 PCR 引物1.5 PCR 产物电泳分析 配制 1.5%琼脂糖凝胶，40 V 电泳 120 min，观察结果，凝
9、胶成像系统成像。1.6 数据分析 对于每一个样品，其浓度和荧光信号增长高于背景或达到阈值时对应的循环数（Ct 值）一一对应。通过标准曲线，Lightcycler 配套软件可计算出待测样品的初始模板量。通过这些数值，我们可以计算出每个样品 femA 基因相对拷贝数。2 结 果52.1 实时荧光定量 PCR 检测方法的评估 以 BB270 提取的 RNA逆转录成的 cDNA10 倍稀释分别制作目的基因和内参基因扩增标准曲线，见图 1，2。同时得出目的基因扩增方程 Y1=-3.167X1+14.92、内参基因扩增方程 Y2=-3.286X2+14.81（Y：每个 PCR 反应测得的 Ct 值；X：原
10、始基因拷贝数的对数值） 。目的基因熔解曲线见图 3。通过设计金黄色葡萄球菌 femA、gyrB 基因对应的特异引物，熔解曲线显示出很清晰的熔解峰，而没有其他的非特异产物，以 BB270 为参照，每组样本都呈现出良好的线性标准曲线。2.2 femA 基因在所检测菌株中的存在情况 在所有选取的 16 株菌中均检测到 femA 基因的表达。2.3 femA 表达水平 以 BB270 femA 表达水平为标准，定为100%，其他菌株 femA 表达水平均与之相比。金黄色葡萄球菌MIC 与 femA 表达水平关系见表 2。可以看出 femA 表达水平随MIC 水平的变化而变化。 表 2 16 株金黄色葡
11、萄球菌 femA 表达水平3 讨 论实时荧光定量 PCR 是近年来定量核酸较为准确的方法，可根据样品的循环阈值参照标准曲线，经计算机处理后可准确计算出标本6内核酸的起始浓度。SYBR Green 是一种只与双链 DNA 结合的染料，当它与双链 DNA 结合时，发出荧光，随着 PCR 产物的增加，产物与 SYBR Green 结合的量也增大，每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，整个过程要求高质量的 RNA、内参和目的基因引物特异性、PCR 扩增效率一致、重复试验平衡差异等来保证结果的可靠性。本实验基于 SYBR Green 的实时荧光定量 PCR 方
12、法用于本实验所得结果标准曲线线性关系好，熔解峰单一，复管及重复试验结果一致，证明特异性好、可信度高。femA 是 MRSA 耐药表达的重要辅助基因，参与细胞壁肽聚糖五肽交联桥 2，3 位甘氨酸的加入，缺失时能导致金黄色葡萄球菌对苯唑西林耐药水平的下降2 。本文检测到所有菌株中均有 femA表达，与 femA 涉及到金黄色葡萄球菌细胞壁肽聚糖合成的功能有关。本文主要为比较不同菌株之间 femA 表达水平有无差异，故并未构建标准 RNA 定量标准品，而仅以高耐菌株 BB270 的 femA 表达量为基准，用实时荧光定量 PCR 相对定量比较了不同菌株 femA表达水平高低，结果提示高耐株 femA
13、 表达水平明显高于低耐和敏感株，与预期结果一致，但检测菌株数量较少尚不能得出统计学结论，有待于进一步扩大样本量后明确。综上，采用荧光定量 PCR 方法检测金黄色葡萄球菌 femA 并进7行相对定量，是一种稳定性、精确度、特异性较好的检测方法。【参考文献】 1 Berger-Bchi B, Barberis-Maino L, Strssle A, et al. femA， a host-mediated factor essential for methicillin resistance in Staphylococcus aureus: molecular cloning and chara
14、cterization J. Mol Gen Genet，1989，219（1-2）:263-269.2 Maidhof H, Reinicke B, Blmel P, et al. femA, which encodes a factor essential for expression of methicillin resistance, affects glycine content of peptidoglycan in methicillin-resistant and methicillin-susceptible Staphylococcus aureus strains J .
15、 J Bacteriol,1991,173(11):3507-3513.3 Hegde SS, Shrader TE. femABX family members are novel nonribosomal peptidyl transferases and important pathogen-specific drug targets J. J Biol Chem,2001,276(10):6998-7003.4 Christiane G, Silvia C, Manfred G, et al. Direct 8quantitative transcript analysis of th
16、e agr regulation of Staphylococcus aureus during human infection in comparison to the expression profile in vitro J . Infect Immunity,2000,68(3):1304-1311.5 Vandecasteele SJ, Peetermans WE, Merckx R, et al. Quantification of expression of Staphylococcus epidermidis housekeeping genes with Taqman quantitative PCR during in vitro growth and under different conditions J. J Bacteriol,2001,183(24):7094-7101.6 Goerk
