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1、1定向基因传递载体 pET15bZVP1 的构建【摘要】 目的 在 JCV VP1 氨基末端插入 SPA 的 IgG 结合区(Z 区) ，构建原核表达质粒 pET15bZVP1。方法 PCR 扩增 JCV 基因组VP1 和 SPA 基因的 Z 片段;重组 PCR 连接 Z 片段和 VP1;BamH和 Nco双酶切将 ZVP1 片段插入原核表达质粒 pET15b。结果 经 PCR 扩增和琼脂糖凝胶电泳纯化，分别得到 VP1 和 Z 片段;再用重组 PCR 将 Z 片段和 VP1 连接成 ZVP1 重组基因;双酶切将ZVP1 插入 pET15b 的 BamH和 Nco两个酶切位点之间，并经酶切鉴定
2、和 DNA 测序证实。Western blotting 证明pET15bZVP1 在体外表达重组蛋白 VP1Z。结论 成功在 VP1氨基末端插入 Z 区，构建了原核表达质粒 pET15bZVP1，并体外表达重组蛋白 VP1Z。 【关键词】 基因治疗;定向基因传递;JC 病毒)ABSTRACT:Objective To construct the vector pET15bZVP1 by inserting the Z fragment into aminoterminal of JCV VP1. Methods The VP1 and Z fragment were amplified by
3、PCR from plasmid pET15b and pEZZ18 respectively, and then they were linked by recombinant PCR. The ZVP1 fragment was inserted into 2plasmid pET15b by restriction enzyme BamH and Nco. Results The VP1 and Z fragment were obtained by PCR and gel purification. The ZVP1 fragment, which was linked by reco
4、mbinant PCR from VP1 and Z fragment, was inserted into plasmid pET15b between BamH and Nco sites, and confirmed by enzyme digestion and DNA sequencing. The expression of VP1Z was confirmed by Western blotting. Conclusion The plasmid pET15bZVP1 has been constructed successfully by inserting Z fragmen
5、t into aminoterminal of VP1.KEY WORDS: gene therapy; targeted gene delivery; JC virus随着人口老龄化的迅速发展，许多中枢神经系统疾病将会严重威胁人们的健康。对于这些疾病至今仍缺少有效的治疗方法，基因治疗被认为是最有希望的方法之一，而制约基因治疗的核心是缺少理想的基因载体1。JC 病毒(JCV)是一种嗜神经病毒，其主要外壳蛋白 VP1 在体外可自我组装成病毒样颗粒(VLP)2 。研究证明3VLP 具有与完整病毒相同的受体结合、胞吞转运等生物活性。在体外，VLP 可经二硫苏糖醇(DTT)和 EGTA 裂解为 VP1
6、 单体; 含钙离子溶液透析时，VP1 又可重新组装成 VLP，并包裹外源性 DNA4。3因此，VLP 具有基因载体的基本特性。由于 JCV 受体广泛分布于多种组织来源的细胞表面5，因此，VLP 作为基因载体缺乏组织细胞特异性。如能使其具有靶向性，特异性结合到靶细胞，则 VLP 有望成为一个理想的中枢神经系统基因载体。研究表明67 ，从金黄色葡萄球菌细胞膜提纯的蛋白质A(SPA)，能与 IgG 抗体 Fc 端结合，将 SPA 的 IgG 结合区(Z 区)插入某一蛋白质，该蛋白质即具有 IgG 结合功能。体外限制性蛋白水解分析发现，JCVVP1 氨基末端暴露于 VLP 表面，对 VLP 颗粒形状维
7、持并非必需，体外修饰并不影响 VLP 的生物特性4。如果将SPA 的 Z 区插入 VP1 氨基末端，体外重组病毒样颗粒 (VLPZ)，不仅保持 VLP 原有的生物特性，同时也具有 IgG 结合功能。借助特异性抗体，VLPZ 可特异性结合到靶细胞，实现治疗基因的定向传递。为此，本研究在 JCV VP1 氨基末端插入 SPA Z 区，构建原核表达质粒 pET15bZVP1。1 材料与方法1.1 材料 质粒 pET15bVP1 由北海道大学医学部分子细胞病理研究室澤洋文教授惠赠， VP1 片段全长 1065bp。质粒pEZZ18 购自 Pharmacia Biotech 公司，包含两个重复的 Z 片
8、段，每个 Z 片段全长 174bp。质粒 pET15b 购自 Novagen 公司，为含4T7 启动子的表达质粒，氨苄青霉素抗性，全长 5708bp。1.2 方法1.2.1 扩增 VP1 片段 上游引物VP15GCTCAGGCGCCGAAAATGGCCCCAACAAAAAG;下游引物 VP13GACAGGATCCTTACAGCATTTTTGTCTGCAAC。下游引物中引入 BamH酶切位点，加下划线表示，扩增基因片段长1065bp。用 2L 质粒 pET15bVP1 为模板，PCR 试剂盒进行扩增。PCR 反应条件为：预变性 95 2min 30s，变性 94 30s，退火55 30s，延伸
9、72 1min 20s，共 20 个循环;72 延伸 5min，终止反应。PCR 产物用 20g/L 琼脂糖凝胶电泳，确定目的条带，按照 TIANGEN 公司琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒说明书操作，回收目的 DNA(VP1 片段)。1.2.2 扩增 Z 片段 上游引物Z5CTGCGCAACACGATGCCATGGTAGACAACAAA，下游引物Z3 CTTTTTGTTGGGGCCATTTTCGGCGCCTGAGC。上游引物中引入 Nco酶切位点，加下划线表示，扩增基因片段长 174bp。5用 2L 质粒 pEZZ18 为模板，PCR 试剂盒进行扩增。PCR反应条件为：预变性 95 2min
10、30s，变性 94 30s，退火 55 30s，延伸 72 30s，共 20 个循环;72延伸 5min，终止反应。PCR 产物用 20g/L 琼脂糖凝胶电泳，确定目的条带，按照TIANGEN 公司琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒说明书操作，回收目的DNA(Z 片段)。1.2.3 双重 PCR 连接 Z 片段和 VP1 片段 以胶回收的 2L Z片段和 2L VP1 片段为模板，分别以 Z5和 VP13为上、下游引物，建立 PCR 反应体系。PCR 反应条件为：预变性 95 2min 30s;变性 94 30s，退火 55 30s，延伸 72 1min 20s，共 20个循环;72延伸 5min
11、，终止反应。PCR 产物用 20g/L 琼脂糖凝胶电泳，确定目的条带，按照 TIANGEN 公司琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒说明书，回收目的 DNA(ZVP1 片段)。1.2.4 将 ZVP1 插入 pET15b 连接的 ZVP1 片段和质粒pET15b 分别用 BamH和 Nco进行双酶切，酶切产物用 20g/L琼脂糖凝胶电泳，胶回收目的 DNA。胶回收的 ZVP1 片段和质粒pET15b 应用 T4DNA 连接酶连接，4过夜，胶纯化连接产物。1.2.5 连接产物的鉴定 重组质粒 pET15bZVP1 以BamH和 Nco双酶切，20g/L 琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统6观察，进行双酶切鉴
12、定;BamH和 Nco双酶切鉴定筛选出的阳性克隆质粒交给生物公司，使用 T7 和 T7ter 测序。1.2.6 VP1Z 的表达和纯化 应用热激发将重组质粒pET15bZVP1 转化进入感受态细胞 BL21(DE3)/plys，次日挑取单菌落接种于含氨苄青霉素的 LB 培养基上 37过夜培养。以1100 的比例转接菌液，37继续培养 3h，加入终浓度 1mmol/L的 IPTG，30继续振荡培养 4h，以诱导 VP1Z 的表达。离心集菌后，以结合缓冲液重新悬浮，加入溶菌酶冰上反应 30min，超声破碎细胞，离心收集上清。参照 VLP 的制备方法 4制备 VLPZ。2 结 果2.1 制备 VP1
13、 以 pET15bVP1 为模板，PCR 扩增 VP1 片段。PCR 产物进行凝胶电泳，显示扩增产物为单一条带，与 VP1 长度(1064bp) 接近，证明成功扩增了 VP1 片段 (图 1)。胶回收 VP1 片段。图 1 胶回收的 VP1 片段Fig.1 Purified VP1 fragment72.2 制备 Z 片段 以 pEZZ18 为模板，PCR 扩增 Z 片段。取PCR 扩增产物进行凝胶电泳，显示扩增产物为单一条带，与 Z 长度(174bp)接近，证明成功扩增了 Z 片段(图 2)。胶回收 Z 片段。图 2 胶回收的 Z 片段Fig.2 Purified Z fragment2.3
14、 连接 ZVP1 片段 取胶回收的 VP1 片段和 Z 片段进行双重 PCR。凝胶电泳显示 PCR 扩增产物为单一条带，片段长度与ZVP1(1239bp)接近，证明成功将 Z 片段和 VP1 连接成ZVP1(图 3)。胶回收 ZVP1 片段。图 3 胶回收的 VP1Z 片段Fig.3 Purified VP1Z fragment2.4 构建 pET15bZVP1 为了将 ZVP1 片段插入质粒pET15b 中，取质粒 pET15b 和 ZVP1 分别用 BamH和 Nco进行双酶切，酶切产物应用 DNA 连接酶连接，反应产物进行凝胶电泳，显示连接产物为单一条带，证明成功将 ZVP1 片段插入到
15、质粒 pET15b 中( 图 4)。8图 4 构建的质粒 pET15bZVP1Fig.4 Plasmid pET15b ZVP12.5 pET15bZVP1 的酶切鉴定 为了证明 ZVP1 插入原核表达质粒 pET15b，取制备的重组质粒 pET15bZVP1 进行BamH和 Nco双酶切，酶切产物进行凝胶电泳，结果显示：酶切产生了 1239bp 和 5000bp 两个片段，分别与 ZVP1 和质粒pET15b 位置相同，证明 ZVP1 成功插入到质粒 pET15b 中(图 5)。2.6 PET15bZVP1 的测序鉴定 为了进一步证实 ZVP1插入到质粒 pET15b 的 BamH 和 Nco两个酶切位点之间，将提取的重组质粒 pET15bZVP1 送上海生工测序鉴定。前向测序从40bp 开始，CCATGG 为 Nco酶切位点，后接 Z、VP1 序列;后向测序，从 24bp 开始， GGATCC 为 BamH酶切位点, 后接 VP1 序列，证实 ZVP1 片段成功插入 pET15b。图 5 pET15bZVP1 双酶切电泳Fig.5 Identification of pET15bZVP1 by digestion with restriction enzyme91：标准核酸分子质量;2：质粒 PET15b;3：ZVP1 片段;4 ：质粒 PET15bZVP1 经 BamH
