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1、1大肠癌转移淋巴结构建人源性抗大肠癌噬菌体 Fab抗体库作者：刘锐 孙立娟 何成彦 周劲松【摘要 】 目的 构建人源性抗大肠癌噬菌体 Fab 抗体库。方法 术中剥取老年大肠癌患者系膜内转移淋巴结，提取细胞总 RNA，逆转录合成 cDNA，进行 PCR，克隆于 pComb3 载体,再经电转化大肠杆菌 XLIBlue 菌株, 形成噬菌体抗体库，最后通过免疫印记法鉴定初级抗体库中噬菌体上有 Fab 段的表达。结果 从系膜内转移淋巴结中扩增出 650 bp 重链 Fd 和轻链基因产物，轻链基因产物插入测得转化菌数为 4.7106，鉴定插入率为 70%；重链 Fd 基因产物测得转化菌数为 3.5106，
2、插入率为 60%；免疫印迹法鉴定成功建立噬菌体 Fab 抗体库，库容量达 1.4106。结论 筛选大肠癌特异性抗原和相应噬菌体抗体，对大肠癌发病机制的研究以及探讨早期诊断方法有重要意义。 【关键词】 大肠癌；噬菌体；抗体目前所知的与大肠癌相关的抗体不仅有限，而且特异性不高，因此寻找大肠癌相关特异性抗原以及高特异性、高亲和性抗体一直备受学者关注。抗体技术已发展到基因工程阶段，人源性基因工程2抗体异源性弱，利用抗体工程技术可提高其亲和力，延长半衰期。用 PCR 技术克隆抗体可变区基因和在大肠杆菌中表达有抗体活性的免疫球蛋白分子片段，是基因工程抗体技术的两个关键基础条件。噬菌体抗体库技术就是在此基础
3、上发展起来并得到应用。目前国内外已有学者开展了大肠癌抗体库的研究，并建立了相应库容的大肠癌噬菌体抗体库1， 2 。本研究首先从大肠癌患者转移的淋巴结构建人源性抗大肠癌噬菌体 Fab 抗体库，并为进一步研究工作奠定基础。1 资料与方法1.1 病例选择随机选取 5 例于我院行大肠腺癌（C 期 2 例，D 期 3 例）根治术的患者，年龄均60 岁,术中剥取系膜内转移淋巴结 35 枚，共 18 枚（直径均 1 cm 以上，将所取淋巴结剖为两半，一半留作建库用，一半送检病理） ，切取大肠癌组织及正常大肠黏膜层组织各 1 g 左右。术后这 5 例患者的切除标本均经病理诊断证实为大肠腺癌，所取 18 枚淋巴
4、结中，14 枚病理诊断证实为转移淋巴结。切取大肠癌组织及正常大肠黏膜层组织各 1 g 左右。随即置液氮中保存备用。31.2 载体、菌株和辅助噬菌体采用噬菌体载体 pComb3,由 The Scripps Research Institute 提供，含质粒 CO1E1 的起始位点、 F1 噬菌体的复制起始位点及氨苄青霉素（Amp）抗性基因；轻链及重链 Fd 的表达均受Lacz 启动子控制。整个载体大小 4 890 bp。宿主菌采用大肠杆菌XLIBlue,由 The Scripps Research Institute 提供,基因型 Tn10 上带有四环素（Tet）抗性基因。辅助噬菌体采用 VCS
5、M13，由 The Scripps Research Institute 提供，含卡那霉素（Kan ）抗性基因，滴度 1 012 pfu/ml。自行培养扩增后 4 保存。1.3 主要试剂RTPCR 和 PCR 试剂盒购自 Promega，限制性内切酶和连接酶购自 Promega。RTPCR 和 PCR 引物参照 The Scripps Research Institute 提供的引物组设计, 由上海基康生物技术公司合成。其他化学分析试剂、细菌培养平皿等为国产。1.4 淋巴细胞的分离纯化、细胞总 RNA 的提取（Trizol 法） 、cDNA 的合成（Gibco BRL 法） 均按试剂盒说明进行
6、。1.5 PCR 扩增 Fab 抗体基因41.5.1 引物序列见表 1。表 1 引物序列（略）1.5.2 PCR 扩增 Fd 及轻链基因(1)在 250 l 薄壁 PCR 反应 Eppendorf 管中加入：cDNA 2 l;5端引物（60 pmol/L）1 l; 3端引物（60 pmol/L）1 l;去离子水 71 l 置 94 45 min 后，立即置于冰上，瞬时离心，在管中加入：10PCR 缓冲液 10 l;25 mmol/L MgCl2 6 l;10 mmol/L dNTPs 8 l;Taq 酶(5 U/l)0.51 l，瞬时离心后，加入12 滴液体石蜡。(2)反应条件：94，1 mi
7、n；52 ，1 min；72，2 min。35 个循环，72延伸 10 min，置于 4 。(3) 每个反应管中各取 5 l PCR 反应物，加入适量 TAE 缓冲液及 DNA 凝胶电泳加样缓冲液，在 0.8%1%琼脂糖凝胶中电泳。1.6 PCR 产物的纯化（spinX 纯化方法） 。1.7 Fd 和轻链基因的克隆及噬菌体抗体库的建立1.7.1 噬菌体载体 pComb3 DNA 的制备5将 pComb3 载体 DNA 转化 XLIBlu 感受态菌，挑取单个菌落接种入 3040 ml SBA+培养液，次日转种 500 ml SBA+培养过夜 DNA 提取试剂盒 1 提取质粒 DNA，最后制成 5
8、 g/l 浓度左右的质粒 DNA。1.7.2 载体 DNA 和纯化 PCR 产物的酶切首先将所有不同的重链 PCR 产物， 链 PCR 产物，以及 PCR 产物分别按各自组群混合。在 pComb3 系统中，用于重链插入的酶切位点为 Spe和 Xho ；而用于轻链插入的酶切位点为Xba和 Sac。酶缓冲液的使用：酶切反应按常规进行，反应后进行电泳以纯化所需的片段。1.7.3 Fd 和轻链基因的克隆（1）轻链抗体基因的克隆; 取上述经 Xba 和 Sac酶切消化，并经电泳纯化后的 pComb3 载体 DNA 1.52 g，轻链混合物 500700 ng，加 2 l 高浓度连接酶进行连接。取事先制备
9、好的电转感受态菌 XLIBlue 400 l 加入上述连接产物，置冰浴中进行电转化。电转后立即转入细菌培养箱中。取 30 l 培养液分别涂于含有氨苄青霉素的 LB 平皿，检测转化效率。用 DNA 纯化试剂盒制备上述含有轻链基因插入的 pComb3 质粒 DNA，并测定 DNA 含6量。鉴定插入效率，随即挑取 20 个克隆，提取质粒 DNA 后，用Xba和 Xac酶切。 （2 ）重链基因的克隆及噬菌体抗体库的建立:取上述的纯化 pComb3LDNA 质粒 10 g，混合的纯化重链 PCR产物 500 ng，用 Xho和 Spe分别进行酶切反应。电泳回收相应的条带，纯化后测定 DNA 含量。取酶切
10、消化后回收纯化的载体DNA 及重链 PCR 产物进行连接。重复轻链克隆步骤。加入 100 ml SBA+T+；37 震荡培养 1 h。加入 1 012 pfu/ml 的辅助噬菌体VSCM13，37震荡培养 2 h。加入 70 g/ml 卡那霉素，37震荡培养过夜。将上述细菌培养液于 4 以 4 000 r/min 离心 15 min。取上清加入 4%PEG8000 和 3%NaCl，待 PEG 和 NaCl 溶化后，置三角瓶于冰浴中沉淀 30 min。于 4以 9 000 r/min 离心20 min。用 2 ml PBS（pH7.2）重悬噬菌体沉淀，瞬时离心，上清即为噬菌体抗体库，待用或存放
11、于-20。1.8 免疫印迹法鉴定初级抗体库中噬菌体上有 Fab 段的表达将建成的噬菌体 Fab 初级抗体库悬液直接点于硝酸纤维膜（NC）片上，以 pComb3 噬菌体空载体悬液作阴性对照,进行免疫印迹分析，显色后对两组 NC 膜进行比较，鉴定初级抗体库中噬菌体上有 Fab 段的表达。2 结果72.1 大肠癌淋巴结抗体重链 Fd 基因和轻链基因的扩增及鉴定采用 Trizol 一步法自大肠癌患者转移淋巴结中提取总 RNA后，以其为模板 RTPCR 合成抗体重链 Fd 和轻链基因 cDNA，再以该 cDNA 为模板， PCR 扩增抗体重链 Fd 和轻链基因，在 1%琼脂糖凝胶 DNA 电泳中，可获得
12、 650 bp 产物条带，即为重链 Fd 和轻链基因产物，见图 1。2.2 轻链和重链 Fd 基因的克隆及噬菌体 Fab 抗体库的建立将 PCR 扩增的轻链基因产物插入载体 pComb3 后，电转感受态 XLIBlu 菌，扩增培养后，测得转化菌数为 4.7106，随机挑取 20 个单菌落，提取质粒 DNA，鉴定插入率为 70%，见图 2。将PCR 扩增的重链 Fd 基因产物插入有轻链基因插入的 pComb3 载体DNA pComb3L，电转感受态 XLIBlu 菌，扩增培养后，测得转化菌数为 3.5106，随机挑取 20 个单菌落，提取质粒 DNA，鉴定轻链基因的插入率为 60%，见图 3。2
13、.3 鉴定初级抗体库中噬菌体上有 Fab 段的表达8以辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗人 IgG 行免疫印迹检测醋酸纤维膜上 Fab 初级抗体库，结果均显色。而作为阴性对照的pComb3 噬菌体空载体悬液则未显色。表明初级抗体库中噬菌体上有 Fab 段的表达，见图 4。3 讨论在构建噬菌体抗体库时，首先必须克隆出 B 细胞的全套可变区基因。实验表明，杂交瘤细胞、脾细胞、淋巴结细胞、外周血淋巴细胞、甚至体外免疫的细胞都可以作为建库的来源。根据有些学者研究提示，在这些细胞中，以选用淋巴结细胞建库为更好3 ，因为这种细胞有利于筛选到亲和力高和特异性的抗体。本研究所建的抗体库是从经病理证实的大肠癌患
14、者转移淋巴结构建的，因未经人工免疫，所以属于天然抗体库。尽管如此，但人具有的巨大的 V基因库仍然是经过繁殖剔除的，这些 B 细胞一直接触许多不同种类的抗原，尤其是接触肿瘤抗原，在肿瘤抗原的压力选择下已发生基因重排，因此，此类抗体库的库容会小于天然抗体库，但从此类抗体库中却容易筛选到高亲和力的特异性肿瘤抗体。在丧失了一定的多样性的同时，获得了较高的特异性和亲和性。噬菌体抗体库技术使用的载体都是在已有的噬菌粒基础上进行改建的,噬菌粒作为载体的优点是转化率高。但是,此类载体需要有9辅助噬菌体来产生单链基因并组装成有感染力的噬菌粒。为了更有效地合成表达抗体库,各国学者在载体构建方面作了一些探索4，5
15、。本研究中所采用的 pComb3 是一个建库所需的常用载体，使用这些载体构建抗体基因库时,获得的全套重链抗体基因与轻链基因以适当的内切酶消化后,克隆进载体相应酶切位点。目前国内外学者在建库时通常使用该噬菌体载体，因为本实验策略是建立和验证设计的双盲法筛选大肠癌特异性抗原和抗体的方法，建库的目的是为了获得用于进一步筛选的噬菌体试剂，筛选和鉴定有价值的大肠癌抗原和抗体将是以后进一步深入的工作，因此未选用特殊改良的方法、复杂且经费较高的载体。如前所述，本研究建立的抗体库已在体内被肿瘤细胞抗原免疫过，所以近似免疫抗体库，虽然此库容量不算太大，库容量为1.4106，但许多实验室已从此种抗体库中比较容易的
16、筛选出高亲和力的抗体。而该抗体库用没有免疫机体的其他抗原筛选时，其抗体的亲和力降低十倍。用 HIV 阳性病人淋巴细胞构建的一个抗体库，当用于筛选抗 MHC 、抗 dsDNA、CD14、EGF 受体和抗 GD2的抗体时，其亲和力只有 10-3 mol/L，而用同一个库筛选抗gp120 的抗体时的亲和力达 10-8 mol/L6 。这些结果表明，经免疫过的淋巴细胞所构建的抗体库对于筛选特定抗原的片段抗体是非常合适的。10【参考文献】1 吴保平，肖 冰，万田谟，等. 结肠癌患者淋巴结构建抗结肠癌噬菌体 Fab 抗体库J.中华消化杂志，2002；1（22）：158.2 Pimenidou A, Madden LA, Topping KP, et al.Novel CD43 specific phage antibodie
