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1、1多房棘球绦虫重组 BbEm/3Em1433 疫苗诱导小鼠细胞因子变化的研究【摘要】 目的: 研究多房棘球绦虫重组 BbEm/3Em1433疫苗对原头蚴攻击小鼠细胞因子变化的影响。方法: 将重组BbEm/3Em1433 疫苗分别通过皮下注射、 肌肉注射、 鼻腔黏膜接种和口服接种免疫 BALB/c 小鼠 12 周后, 用 50 个多房棘球绦虫原头蚴腹腔注射进行攻击, 攻击感染后 18 周剖杀小鼠, 取脾脏制备淋巴细胞悬液体外培养, 分别以多房棘球绦虫抗原(EmAg)、 刀豆素 A(ConA)刺激诱生白细胞介素 12(IL12)、 白细胞介素10(IL10)和干扰素 (IFN); 以脂多糖 (LP
2、S)刺激诱生肿瘤坏死因子 (TNF)。常规 ELISA 测定脾细胞培养上清液中 IL12、 IL10、 IFN 和 TNF 水平。结果: 与对照组相比,疫苗免疫组IFN、 IL12、 TNF 水平增加, IL10 水平降低, EmAg 刺激组和 ConA 或 LPS 刺激组细胞因子水平明显高于相应的原液组。结论: 多房棘球绦虫重组 BbEm/3Em1433 疫苗可诱导攻击感染小鼠产生 Th1 型细胞免疫应答 , 增强宿主抗多房棘球绦虫感染的保护性免疫反应。 【关键词】 多房棘球绦虫 重组 BbEm/3Em1433 疫苗 原头蚴 细胞因子2泡型包虫病(alveolar echinococcosi
3、s, AE)是由多房棘球绦虫(echinococcus multilocularis, Em)的续绦期幼虫寄生在人体引起的一种严重危害人体健康的人畜共患寄生虫病(zoonosis)。泡球蚴在宿主肝脏呈现酷似肿瘤的侵润性生长, 可诱发宿主的体液免疫和细胞免疫1 。初始 T 细胞获得泡球蚴抗原识别信号而活化为效应 T 细胞, 通过细胞因子而进行免疫调节。近年来研究发现, Thl 和Th2 细胞产生的细胞因子在病程转归中具有重要作用, 可反映宿主机体内免疫应答的反应类型。李富荣等2报道小鼠感染泡球蚴后的前 12 周脾淋巴细胞以分泌 IL2R 和 TNF 为主, 前 8 周呈 Th1反应; 12 周后
4、以 IFN 为主; 16 周后以 IL1 为主, 感染后期 Th2反应逐渐增强; 舒勍 3发现 A/J 小鼠对泡球蚴有相对较强的抵抗力与 T 细胞增生导致高水平的 Th1 细胞因子 IL2 和 IFN 有关; 魏晓丽等4报道 IFN、 TNF 等 Th1 型细胞因子接种泡球蚴后水平均上升, 而 IL4、 IL10 等 Th2 型细胞因子相对维持较低水平, 这些资料表明细胞因子在宿主对泡球蚴的免疫应答中可能起重要作用。本研究在成功构建重组 BbEm/3Em1433 疫苗5的基础上, 用该疫苗免疫小鼠, 然后用多房棘球绦虫原头蚴攻击感染, 研究 Thl 和 Th2 型细胞因子的变化, 探讨该疫苗的
5、保护性免疫机制。1 材料和方法31.1 材料 重组 BbEm/3Em1433 疫苗5由本室构建和保存; Bb 购自武汉大学菌种保存中心。纯系 BALB/c 小鼠(雌性, 体质量 2025 g, 1214 周龄, 共 78 只) 购自重庆医科大学实验动物中心。ConA 购自 Sigma 公司; RPMI1640 培养基、 100 g/L BSA、 青霉素和链霉素购自上海生工公司; IL12、 IL10、 IFN 和 TNF 检测试剂盒购自北京晶美公司。1.2 方法1.2.1 实验分组 78 只雌性 BALB/c 小鼠随机分为 6 组, 每组13 只。SC 组: rBbEm/3Em1433 皮下注
6、射组; IM 组: rBbEm/3Em1433 肌肉注射组; IN 组: rBbEm/3Em1433 鼻腔黏膜接种组; PO 组: rBbEm/3Em1433 口服接种组; Bb 对照组: 100 L Bb 菌液皮下注射组; PBS 对照组: 100 L PBS 皮下注射组。 SC、 IM 组: 5106 CFU 疫苗悬浮于 100 L PBS 于小鼠后背部皮下单次及肌肉注射; IN 组: 5105 CFU 疫苗悬浮于 10 L PBS 于小鼠鼻腔黏膜单次接种; PO 组: 1108 CFU 疫苗悬浮于 60 L PBS 进行口服接种。至室验结束时, SC、 IN 组有 3 只小鼠死亡, PO
7、 组有 4 只小鼠死亡, IM、 Bb、 PBS 组各有 1 只小鼠死亡。1.2.2 攻击感染 疫苗免疫小鼠 12 周后 , 用 50 个多房棘球绦4虫原头蚴腹腔注射进行攻击感染。1.2.3 脾细胞制备 原头蚴攻击感染后 18 周随机挑选各组小鼠 8 只剖杀, 750 mL/L 乙醇消毒 3 min, 无菌取脾, 剪碎, 用注射器针芯碾磨, 1 mL8.5 mL/L 生理盐水冲洗, 200 目尼龙网过滤, 滤液置10 mL 离心管; 加 4 mL 双蒸水使渗透压降至 0.15%溶解红细胞, 10 s, 再加 1.34 mL36 mL/L 生理盐水恢复等渗 ; 用 8.5 mL/L 生理盐水洗
8、2 次, 2500 r/min 离心 5 min, 加入 10 mL8.5 mL/L 生理盐水混匀, 计数细胞 , 调整细胞密度为 5109/L, 加入含 100 g/L BSA 的RPMI1640 培养液 10 mL, 加入青霉素 100 U/mL 和链霉素 100 U/mL。1.2.4 脾细胞培养上清液的制备 将 5109/L 脾细胞加入 24孔细胞培养板, 每份标本设 6 孔, 分别加入 1 mL 原液、 1 mL 原液EmAg 10 mg/L、 1 mL 原液ConA 10 mg/L、 1 mL 原液、1 mL 原液EmAg 10 mg/L 和 1 mL 原液LPS 10 mg/L,
9、前 3孔 3750 mL/LCO2 培养 48 h, 4000 r/min 离心 5 min, 收集上清液, -20冰箱冻存待查 IL12、 IL10 和 IFN; 后 3 孔 3750 mL/LCO2 培养 72 h, 4000 r/min 离心 5 min, 收集上清液, -20冰箱冻存待查 TNF。1.2.5 脾细胞产生的 IL12、 IL10、 IFN 和 TNF 检5测 按 ELISA 试剂盒说明书的实验步骤, 对小鼠血清中 IL12、 IL10、 IFN 和 TNF 的含量分别进行检测, 酶标仪测定 A450值, 以试剂盒提供的标准品绘制标准曲线, 计算细胞因子含量。1.2.6 统
10、计学分析 各组小鼠脾细胞产生的 4 种细胞因子浓度采用 SPSS13.0 软件进行分析, 计量资料采用 t 检验（xs）, 检测结果采用方差分析, 组间两两比较用 LSD。2 结果2.1 IFN 检测结果 SCPO 组中 , 小鼠脾细胞原液组、 EmAg 刺激组和 ConA 刺激组 IFN 水平均明显高于 PBS 对照组(P0.01); Bb 对照组与 PBS 对照组相比, 差别无统计学意义; 每个 ConA 刺激组 IFN 水平明显高于相应的原液组或 EmAg 刺激组(P0.05 或 P0.01)。在 EmAg 刺激组和 ConA 刺激组中, SC 组 IFN 水平明显高于 IM 组、 IN
11、 组和 PO 组(P0.05 或P0.01), IM 组、 IN 组和 PO 组之间无统计学意义(表 1)。表 1 重组 BbEm/3Em1433 疫苗免疫原头节攻击后小鼠 IFN 的检测（略）Tab 1 Detection of IFN in mice immunized with 6recombinant Bb vaccine and challenged with protoscolecesbP0.01 vs PBS control group.2.2 IL12 检测结果 SC 组和 IN 组小鼠脾细胞原液组、 EmAg 刺激组和 ConA 刺激组 IL12 水平均明显高于 PBS 对照
12、组(P0.05 或 P0.01); IM 组、 PO 组和 Bb 对照组与 PBS 对照组相比, 差别无统计学意义。EmAg 刺激组和 ConA 刺激组中, SC组 IL12 水平明显高于 IM 组和 PO 组(P0.05 或 P0.01), 余无统计学意义。每个 ConA 刺激组 IL12 水平明显高于相应的原液组或 EmAg 刺激组(P0.05 或 P0.01); 每个 EmAg 刺激组IL12 水平明显高于相应的原液组(P0.05 或 P0.01, 表 2)。表 2 重组 BbEm/3Em1433 疫苗免疫原头节攻击后小鼠 IL12 的检测（略）Tab 2 Detection of IL
13、12 in mice immunized with recombinant Bb vaccine and challenged with protoscolecesaP0.05, bP0.01 vs PBS control group.2.3 TNF 检测结果 SC 组、 IM 组和 IN 组小鼠脾细胞原液组、 EmAg 刺激组和 LPS 刺激组 TNF 水平均明显高于 PBS7对照组(P0.05 或 P0.01); PO 组和 Bb 对照组与 PBS 对照组相比, 差别无统计学意义。在 EmAg 刺激组和 LPS 刺激组中, SC 组TNF 水平明显高于 IM 组、 IN 组和 PO 组(P
14、0.01) 。每个LPS 刺激组 TNF 水平明显高于相应的原液组或 EmAg 刺激组(P0.01); 每个 EmAg 刺激组 TNF 水平明显高于相应的原液组(P0.01, 表 3)。表 3 重组 BbEm/3Em1433 疫苗免疫原头节攻击后小鼠 TNF 的检测（略）Tab 3 Detection of TNF in mice immunized with recombinant Bb vaccine and challenged with protoscolecesaP0.05, bP0.01 vs PBS control group.2.4 IL10 检测结果 SC 组和 IM 组小鼠
15、脾细胞原液组、 EmAg 刺激组和 ConA 刺激组 IL10 水平与 PBS 对照组相比明显降低, 差别有统计学意义(P0.05 或 P0.01); IN 组、 PO 组和 Bb 对照组与 PBS 对照组相比, 差别无统计学意义。每个 ConA刺激组 IL10 水平明显高于相应的原液组或 EmAg 刺激组(P0.05 或 P0.01); 每个 EmAg 刺激组 IL10 水平明显高于相应的原液组(P0.05 或 P0.01, 表 4)。8表 4 重组 BbEm/3Em1433 疫苗免疫原头节攻击后小鼠 IL10 的检测（略）Tab 4 Detection of IL10 in mice immunized with recombinant Bb vaccine and challenged with protoscolecesaP0.05, bP0.01 vs PBS control group.3 讨论IFN 是由抗原诱生的 Th1 型细胞因子, 在抗寄生虫感染的防御机制中能抑制 Th2 型细胞因子的分泌, 主要通过增强巨噬细胞吞噬功能和限制细胞内寄生原虫的增殖发育等方式控制感染
