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1、精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询骨髓间充质干细胞体外诱导分化与标记【关键词】 骨髓【Abstract】 AIM: To study the differentiation characteristics and the optimal dosage and timing for bromodeoxyuridine (Brdu) labeling of rat bone marrowderived mesenchymal stem cells (MSCs) in vitro. METHODS: The rat marrow stem cells isolated by usi
2、ng Percoll (1.073 kg/L) were cultured and proliferated. The third passage cells were induced with dexamethasome, glycerophosphate, ascorbic acid2phosphate, IGF1 and insulin. On day 21, the cells were analyzed by immunohistochemistry for type collagen and by histochemistry for alkaline phosphatase (A
3、KP). The purified MSCs were incubated with Brdu at different concentrations (5, 10 and 15 mol/L) for different time periods (12， 24， 48， 72 and 96 h), followed by immunohistochemistry for Brdu to identify the optimal Brdu concentration and incubation time period. RESULTS: After incubation for 21 d f
4、or induced differentiation into osteoblasts, type collagen and AKP were positively expressed. The incubation with 10 mol/L 精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询Brdu for 72 h achieved over 98% of the labeling rate without producing obvious cell damages. CONCLUSION: MSCs can be induced to differentiate into oste
5、oblasts under certain conditions in vitro. The optimal Brdu labeling concentration and time period are 10 mol/L and 72 h, respectively.【Keywords】 MSCs; induced differentiation; osteoblast; Brdu【摘要】 目的： 探讨骨髓间充质干细胞（MSCs）在体外的诱导分化及 5溴脱氧尿嘧啶核苷(Brdu)标记 MSCs的可行性. 方法： 利用密度为 1.073 kg/L的 percoll分离骨髓的单个核细胞，体外培养
6、与扩增 MSCs；取生长良好的第 3代细胞，用成骨细胞分化培养液培养 21 d，型胶原免疫组化染色和碱性磷酸酶（AKP）组化染色；分别以浓度为 5，10 和 15 mol/L 的 Brdu溶液标记 MSCs，孵育12，24，48，72 和 96 h后免疫组化检测 Brdu，确定最佳标记量和最佳标记时间. 结果： 诱导分化第 21日, AKP染色呈强阳色,型胶原免疫染色呈阳性. 10 mol/L Brdu标记 MSCs的效果最好，随着孵育时间的延长，Brdu 标记率逐渐增高，标记 72 h后标记率在精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询90%以上. 结论：MSCs 在体外一定条件下
7、可定向诱导分化为成骨细胞，用 Brdu标记 MSCs的最佳浓度为 10 mol/L，最佳时间是 72 h.【关键词】 骨髓间充质干细胞；诱导分化；成骨细胞；5 溴脱氧尿嘧啶核苷0引言骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一类具有多向分化潜能的组织干细胞. 因 MSCs取材方便、对机体的损伤小、具有较强的传代增殖能力和免疫耐受性等特点而受到越来越多的关注. 本实验的目的是利用 MSCs具有分化潜能的特点，在体外诱导该细胞定向分化为成骨细胞. 并用 Brdu标记连续传代的 MSCs，观察最佳标记时间及标记剂量，从而为追踪 Brdu标记的 MSCs移植入体内后的
8、存活、生长及分化奠定基础.1材料和方法精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询1.1材料健康雄性 SD大鼠，体质量 5570 g. 由西安交通大学医学院实验动物中心提供.1.2方法1.2.1大鼠骨髓 MSCs的体外分离培养将大鼠引颈处死后置于 750 mL/L乙醇浸泡约 5 min，无菌条件下分离出大鼠的股骨和胫骨. 用PBS冲洗出骨髓细胞，经 5 mL针管反复吹打制成单细胞悬液，用200目的不锈钢网过滤，收集滤液. 在密度为 1.073 kg/L的percoll（Phamacia）分离液上缓慢加入收集的滤液，2500 r/min离心 20 min，收集滤液与分离液之间的白膜层细胞
9、，用DMEM（Gibco）洗涤两次，1000 r/min离心 5 min. 用加有 100 mL/L胎牛血清（杭州四季青公司）的 DMEM重悬细胞，1108 个/L种于两个直径为 6 cm的培养皿中培养，2 d后更换培养液，加入完全培养基. 并将吸出的旧培养液分别移入另两个平皿中继续培养，再过 2 d更换成完全培养基 . 以后每 34 d换液 1次，弃去没有贴壁的悬浮细胞. 待细胞生长融合到约 80%，用 0.2 g/L EDTA和 2.5 g/L胰蛋白酶（宝信公司）消化，12 传代培养.精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询1.2.2传代后大鼠 MSCs向成骨细胞的分化胰酶消化
10、生长良好的第 3代（P3）细胞，以 1107个/L 密度种于 6 cm培养皿中，平皿中预先加入 0.5 cm1.0 cm无菌盖玻片. 待细胞长到约 80%融合后，加入含 200 mL/L胎牛血清的 DMEM诱导 24 h，弃去. 加入诱导液，其中含 0.1 mol/L 地塞米松、 50 mmol/L 维生素 C,10 mmol/L 甘油磷酸钠、IGF1（Chemikon）,胰岛素和 100 mL/L胎牛血清. 同时，设立正常对照组，只加入含 100 mL/L胎牛血清的培养基，其余均不加. 分别诱导 7，14 和 21 d. 取出盖玻片，PBS 冲洗，40 g/L多聚甲醛固定 15 min. 然
11、后应用抗型胶原 mAb（Sigma）和ABC法（ABC 试剂盒购于北京中杉公司）进行型胶原免疫组织化学染色. 加入诱导液组，以 PBS和正常鼠血清分别替代一抗作为阴性对照；应用组织化学钙钴法显示碱性磷酸酶（AKP） ，以不加底物 甘油磷酸钠的孵育液作为阴性对照.1.2.3Brdu标记 MSCs消化 P3细胞，以 0.5108个/L 将 MSCs接种于 12孔培养皿，在将要加入 Brdu的培养皿中预先放入无菌盖玻片. 当细胞铺满皿底 40%时加入 Brdu（Sigma）溶液，使其终浓度分别为 5，10 和 15 mol/L. 孵育 12，24，48，72 和 96 h后取出盖玻片，用 PBS冲洗
12、，40 g/L多聚甲醛固定 15 min，应用抗 Brdu mAb（Sigma）和 ABC法进行免疫组织化学染色显示 Brdu，除在正常精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询血清封闭前以 2 mol/L盐酸变性 30 min外，其余均按试剂盒说明书进行操作. 以 PBS和正常鼠血清分别替代一抗作为阴性对照. 另外，将用 10 mol/L Brdu标记的 MSCs进行传代培养，观察细胞传代后的标记效果.上一页 1 2下一页1.2.4Brdu毒性观察以 Brdu标记 MSCs，同时以未经 Brdu标记的 MSCs作为正常对照. 在倒置相差显微镜（Olympus）下观察传代细胞的形态变
13、化和生长状况，确定 Brdu有无毒性.统计学处理： Brdu免疫组织化学染色后，随机取 10个非重叠视野（100）计数 Brdu阳性细胞数，计算 Brdu标记率. 数据以xs表示，采用 SPSS 10.0软件进行方差分析及 LSDt两两比较，P 0.05为差异有统计学意义.2结果2.1原代培养的 MSCs形态学变化原代培养中, 接种后数小时即可见部分细胞贴壁. 23 d时，贴壁细胞数量明显增多，逐渐伸展精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询成为梭形. 贴壁细胞是以分散的克隆集落方式生长 . 34 d时可见细胞集落增大. 710 d细胞迅速增生,呈辐射状排列. 高倍镜下可见细胞为长
14、梭形，有 2个或多个突起，细胞核椭圆形，有 23 个清晰的核仁（图 1）. 培养至 20 d时贴壁细胞接近 80%90%融合. 传代细胞在 12 h内完全贴壁，重新变为梭形细胞. 细胞传代后以均匀分布的方式生长，生长迅速，大约 710 d 达到完全融合.2.2MSCs向成骨细胞的分化在诱导分化的第 7日，细胞由梭形开始变为多角形, 第 14日，部分细胞变宽大，且伸出多个丝状突起；AKP染色呈黑褐色，型胶原免疫组化染色阳性不明显. 第 21日，AKP染色呈强阳色,型胶原免疫组化染色呈阳性（图 2）. 正常对照组和阴性对照实验均未见明显染色.2.3Brdu标记率以不同浓度 Brdu标记发现（表 1
15、，图 3）：标记4872 h，5 mol/L 的标记率约为 70%， 10 mol/L 的标记率约为 90%，该标记率与 15 mol/L Brdu的标记率没有显著差别 . 同时发现：以不同时间标记，随着标记时间延长阳性细胞数增多. 标记 72 h细胞阳性率90%, 但标记时间继续延长（96 h）标记细胞数目无明显增多. 阴性对照未见染色. 为此，我们选用终浓度为 10 mol/L 的 Brdu标记 72 h作为最佳标记浓度和时间进行后续试验. 精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询连续传 10代后仍可见 Brdu免疫染色阳性细胞，但数量越来越少. 在相差显微镜下观察细胞的形态及
16、生长增殖速度，与正常对照组细胞比较未见明显差异.表 1不同浓度 Brdu在不同时间标记 MSCs的标记率（略）3讨论骨髓 MSCs具有自我更新和多向分化的潜能1 ， 已经成为重要的组织工程种子细胞2-3. 由于 MSCs具有多种标志，而目前尚未筛选到其独有的标志分图 310 mol/L Brdu标记 MSCs 12(A, 400), 48 (B, 100)和 72 h (C, 100)子，给 MSCs的鉴定带来一定困难4. 目前 MSCs的鉴定常采用两种方法：排除法：骨髓中不表达内皮细胞、成纤维细胞、造血干/祖细胞、血细胞抗原的细胞，而上述细胞分别有 CD34和/或CD45的表达：逆推法：在培养过程中，给予适当刺激因子，细胞出现分化表型，如向成骨、成脂方向诱导分化等，从而逆推其为MSCs5. 我们采用后者，给细胞加入诱导液，诱导其向成骨细胞分化，诱导成功，从而证实得到的细胞即为 MSCs.细胞移
