《食管癌细胞中fascin基因启动子区的克隆与初步鉴定》由会员分享，可在线阅读，更多相关《食管癌细胞中fascin基因启动子区的克隆与初步鉴定（12页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询食管癌细胞中 fascin 基因启动子区的克隆与初步鉴定作者：杨章民，郭张燕，许丽艳，高书颖，谢剑君，李恩民 【摘要】 目的：对食管癌细胞中 fascin 基因启动子区进行克隆鉴定. 方法：应用 PCR 技术从食管癌细胞系 EC109 中扩增出 fascin基因 5侧翼区 5 段不同长度的片段，并将其克隆至萤火虫荧光素酶报告基因表达载体 pGL3Basic （pGLB）中, 然后将这些质粒与对照质粒 pGLB、内参照质粒 pRLTK 共转染 EC109 细胞，48 h 后用双荧光素酶检测系统分析这些重组子报告基因转染细胞的相对荧光强度，并结合
2、生物信息学分析，以判断 fascin 基因启动子区所在位置. 结果：用 DNA 重组技术成功构建了 5 个系列缺失重组荧光素酶报告基因表达载体. 相对荧光素酶活性检测表明，与对照组相比，上述一系列重组质粒转染细胞均显示出较高的荧光素酶活性. 生物信息学分析发现，在启动子区(-436+1)有标志性调控元件 TATA 盒(-34-29). 结论：在食管癌细胞中 fascin 基因的启动子区可能位于转录起始位点上游约 436 bp 的区段内. 【关键词】 fascin 基因； 食管肿瘤； 启动子； 荧光素酶类； 报告基因 【Abstract】 AIM: To clone and identify t
3、he promoter region of fascin gene in esophageal carcinoma cells. 精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询METHODS: Five different length fragments of 5 flanking region of fascin gene were amplified from the genomic DNA of EC109 (an esophageal cancer cell line) by using PCR and cloned into luciferase reporter gene
4、vector pGL3Basic （pGLB）, which aids in verification of functional promoter elements. Then the relative luciferase activities of the report genes in the EC109 cells transfected with these recombinant plasmids were analyzed by Dual Luciferase Reporter Gene Assay System (DLR). Bioinformatic analysis wa
5、s also performed to determine the position of fascin gene promoter. RESULTS: Five serial deletion recombinant luciferase report gene expression vectors pBF-2900- -436 were successfully constructed by using DNA recombination technique. 48 h after cotransfection of these recombinant plasmids with cont
6、rol pGLB, pRLTK vector into EC109 cells, the relative luciferase activities of the cells transfected with these recombinant plasmids were all higher, as compared with controls. Bioinformatic analysis unveiled a TATA box (-34- -29), which was the marked regulatory element, in this promoter region (-4
7、36- +1). CONCLUSION: The promoter region of fascin gene is likely located in the region of 436 bp upstream of the transcriptional initiation 精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询site in esophageal carcinoma cells. 【Keywords】 fascin; esophageal neoplasms; promoter; Luciferase; Reporter Gene Assay 0 引言 研究表明，癌细胞侵
8、袭转移的恶性行为是由于肌动蛋白结合蛋白等因素引起的细胞骨架异常重组所致1. 成束蛋白（fascin）是肌动蛋白结合蛋白中与癌细胞运动时丝状伪足、微棘异常形成有关的主要分子，在食管癌及许多上皮来源的肿瘤细胞系中高表达，与癌侵袭转移密切相关，被认为是癌早期转移诊断的重要生物标志2-3. 但目前该基因在肿瘤细胞中上调表达的分子机制尚不清楚. 我们拟从 fascin 基因上游调控区入手，采用系列缺失结合双荧光素酶报告基因检测分析法，初步鉴定其启动子区的所在位置，为鉴定食管癌细胞中与其启动子结合的转录因子、阐明其表达调控机制奠定基础，也为以其转录因子为靶分子进行肿瘤生物治疗提供依据. 1 材料和方法 1
9、.1 材料 E.coli JM109 菌株，萤火虫荧光素酶报告基因表达载体pGL3Basic （pGLB） ，内参照荧光素酶报告基因表达载体pRLTK ，PCR mix，LigaFast Rapid DNA Ligation System, 双荧光素酶报告基因分析系统(DualLuciferase Reporter Assay 精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询System)及限制性内切酶（KpnI, Mlu I, Hind III）(美国 Promega公司)；质粒提取试剂盒 QIAprep Spin Miniprep Kit（美国 QIAGEN 公司） ；转染试剂 Fug
10、ene6（Roche 公司） ； pMD18T Vector 及 LA PCR kit（日本 TaKaRa 公司） ；食管癌细胞系 EC109 由中国医学科学院肿瘤研究所林晨研究员惠赠；萤光发光计 TD20/20 luminometer（Turner Designs）. 1.2 方法 1.2.1 细胞培养 将食管癌细胞系 EC109 培养于含 100 mL/L 小牛血清,1105 U/L青霉素,100 mg/L 链霉素的 199 培养基中，50 mL/L CO2，37. 用含 2.5 g/L 胰蛋白酶和 0.2 g/L EDTA 的消化液消化传代. 1.2.2 PCR 引物设计与合成 根据 G
11、enBank 中报道的 fascin 基因上游调控区序列（Accession No. AY044229） ，运用 Primer Premier 5 软件，设计 5 对针对其上游调控区的系列缺失引物，由上海基康公司合成. 其中，5 对引物中的下游引物相同（FasnR） ，上游分别针对不同的缺失部位，各引物的序列及目的片段的大小见表 1.表 1 从食管癌细胞系 EC109 扩增 fascin 基因 5侧翼区的引物（略） 1.2.3 PCR 扩增 以食管癌细胞 EC109 基因组 DNA 为模板，以 F2900 和 FasnR 为引物，应用 PCR mix 扩增 fascin 基因 5侧翼区约 30
12、00 bp 片段，产物命名为 3022. PCR 条件为：94, 5 min 预变性； 然后按照 98 精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询20 s，63 5 min, 共 30 个循环； 最后 72延伸 10 min. 再以pTF2900 为模板，分别以 F1848，F1435，F825，F436 和 FasnR 为上、下游引物，应用 PCR mix 及与上述相同的反应条件扩增系列相差约 500 bp 的片段，产物命名为 1970，1547，947，558. 各 PCR产物进行 10 g/L 琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色并照相. 1.2.4 PCR 产物的克隆及重组 质粒 p
13、TF-2900-436 的构建以食管癌细胞 EC109 基因组 DNA 为模板扩增的 PCR 产物直接克隆到 pMD18T 或 pGEMT easy vector载体中，按试剂盒操作说明书进行. 用与扩增片段时的引物及相同的反应条件进行 PCR 来鉴定重组子，10 g/L 琼脂糖凝胶电泳检测，最后测序确认，5 个质粒分别命名为 pTF2900, pTF1848, pTF1435, pTF825, pTF436. 1.2.5 系列缺失表达载体的构建与鉴定 以 Kpn I/Hind III 双酶切 pGLB, pTF2900 ，以 Mlu I/Hind III 分别双酶切 pGLB 和 pTF18
14、48, pTF1435, pTF825, pTF436. 分别回收线性化的 pGLB 及不同大小的目的片段，用 T4 DNA 连接酶分别在 4过夜连接，转化 JM109 感受态细胞，试剂盒提取质粒，Kpn I/Hind III 或 Mlu I/Hind III 双酶切鉴定重组子，10 g/L 琼脂糖凝胶电泳检测. 各重组子分别命名为 pBF2900, pBF1848, pBF1435, pBF825, pBF436. 1.2.6 转染和双荧光素酶活性检测 用 QIAprep Spin Miniprep 质粒提取试剂盒分别提取 pBF2900, 精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查
15、询pBF1848, pBF1435, pBF825, pBF436, 空载体质粒 pGLB 以及内参照质粒 pRLTK ，紫外分光光度法分别测定质粒浓度. 用Buffer EB 将上述各质粒稀释至 100 mg/L，内参照质粒 pRLTK 稀释至 20 mg/L.将各种质粒分别与 pRLTK 质粒按 101（V/V）混合. 将处于对数生长期的 EC109 细胞在转染前 24 h 接种于 24 孔培养板中，待细胞密度达到 60%80 %融合时进行转染4. 48 h 后收获细胞，进行双荧光素酶活性检测. 每种质粒设 3 个平行孔，不同批次的质粒转染实验重复 3 次，并分别记录相应的荧光素酶活性.
16、1.2.7 生物信息学分析 应用转录因子数据库（ ）中的软件AliBaba 2.1 分析预测 fascin 基因 5侧翼-436+1 区段潜在的转录因子结合位点. 相关参数分别为：Pairsim to known sites 为64，Match width in bp 设为 10，Min num of sites 为 5，Min match conservation 设为 80. 统计学处理: 根据 TD20/20 型照度计配置的软件包计算各组相对光强度 xs. 以 SSPS 11.0 for Windows 软件包对各组实验数据之间是否有显著性差别进行 F 检验. 2 结果 2.1 fascin 基因 5侧翼区的克隆与 pBF2900 表达载体的构建 琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 产物 3022，所扩增的片段
