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1、1促甲状腺素化学发光免疫定量检测试剂盒的研制 11作者：王青, 王缦, 魏东芝 , 陈寒柏, 张黎明【摘要 】 目的: 研制人血清中促甲状腺素（TSH）的化学发光免疫检测试剂盒。方法: 采用辣根过氧化物酶标记的抗 TSH 亚单位特异性单克隆抗体(mAb), 与固相包被的抗 TSH 亚单位的另一 mAb 配对, 以鲁米诺作为底物 , 采用两步法建立了双位点夹心法人血清 TSH 的化学发光免疫定量分析法。结果: 该方法灵敏度为0.0788 mIU/L, 批内 CV 平均为 4.7%, 批间 CV 平均为 8.4%, 平均回收率为 93.05%。该检测与 LH、 FSH 和 HCG 无交叉反应。部分
2、实验样品的测试结果显示该试剂与国外同类试剂（雅培 architect i2000）的测定结果明显相关(r0.984)。结论: 该方法具有较高的灵敏度、 重复性和准确度, 与其他同类产品相比简便、 快捷、 成本低, 适于临床检测和科研应用。 【关键词】 促甲状腺激素（TSH ） 化学发光免疫分析法 试剂盒促甲状腺激素(thyroid stimulating hormone, thyrotropin, TSH)是一种由垂体前叶分泌的糖蛋白激素, 由 和 2 个亚基组成, 相对分子质量(Mr)为 280001。TSH 本身受下丘脑分泌的 TSH 释放激素 TRH 的调控, TSH 的主要生理作用是调
3、节甲状腺激素的合成2与分泌, 血液中甲状腺激素水平与腺垂体分泌 TSH 的量之间有负反馈抑制关系2。甲状腺功能改变时, TSH 的波动较甲状腺激素更迅速且明显, 是反映下丘脑 垂体 甲状腺轴功能的敏感指标, 因此采用灵敏度高的 TSH 免疫分析法具有重要的意义。化学发光免疫分析(chemiluminescent immunoassay, CLIA)是一种灵敏的免疫分析方法, 在免疫诊断试剂研制中已得到了广泛的应用3 。本研究根据化学发光免疫分析法的原理研制了血清 TSH 的检测试剂盒, 与国内外同类产品相比具有简便、 快捷、 成本低等优点。1 材料和方法1.1 材料 TSH 单克隆抗体(mAb
4、)、 TSH 标准品抗原和辣根过氧化物酶（HRP ）为 Sigma 公司产品, 光免板为 Thermo Electron 公司产品, 化学发光底物为 BioRad 公司产品。1.2 方法1.2.1 标准品的配制 将 TSH 抗原标定后溶于小牛血清中, 配制成含 0.1, 1, 5, 20, 100 mIU/L 的标准溶液。1.2.2 抗体包被板的制备 将 100L 含 TSH mAb（0.5mg/L ）的 pH9.6 碳酸盐缓冲液加至包被板中, 37 包被32 h, 再用含 10 mg/L BSA 的 0.01 mol/L pH7.4 磷酸盐缓冲液于37封闭 2 h 后晾干备用。1.2.3 酶
5、标记物的制备 TSH 的酶标记物采用过碘酸钠法制备, 然后经 0.01 mol/L pH7.4 磷酸盐缓冲液透析过夜后, 加入等量的甘油于-20 保存备用。1.2.4 检测方法 将 50 L 待测样品或标准品加入包被 TSH的光免板中, 37 温育 30 min, 弃反应液, 用洗涤液（含 0.5 mg/L Tween20 的 0.01 mol/L pH7.4 磷酸盐缓冲液）洗 5 次, 加酶标记物 50 L, 37 温育 30 min 后同样用洗涤液洗 5 次, 然后加入发光底物于 510 min 内测定各孔的发光值 RLU。样本中的 TSH 浓度依据由标准品 TSH 浓度和对应的 RLU
6、建立的数学模型进行定量。2 结果2.1 动力学性质 在 HRP鲁米诺H2O2 发光体系中, 将不同量的免疫复合物加入发光液中, 发光强度（RLU）随反应时间而变化。10 min 后 RLU 接近峰值, 在 515 min 内 RLU 较为稳定, 随后开始缓慢下降。2.2 反应条件优化42.2.1 加样量对 RLU 的影响 样本和酶标记物的加样量分别为 50 L 和 100 L 考查标准品（0 、 0.1、 1、 5、 20、 100 mIU/L）RLU, 发现加样量为 100 L 与 50 L RLU 相差不大, 说明50 L 的加样量反应能达到平衡(图 1)。图 1 加样量对 RLU 的影响
7、（略）2.2.2 反应模式对 RLU 的影响 采用二步法。第一步 : 加入标准品和待测样品后, 将反应体系在 37分别温育 15、 30、 45、 60 min; 第二步: 加入酶标记抗体后 , 将反应体系在 37 分别温育15、 30、 45、 60 min。结果表明温育时间为 30 min 时反应皆能达到平衡(图 2)。图 2 温育时间对 RLU 的影响（略）A: 第一步温育时间对 RLU 的影响; B: 第二步温育时间对RLU 的影响.2.3 稳定性 将试剂盒放置于 37 6 d 后, 比较与放置前参考标准品各点 RLU 值, 参考标准品各点 RLU 值未见明显降低, 且本底发光值无明显
8、升高, 表明试剂盒标准曲线无明显漂移, 满足稳定性5要求。2.4 方法学评价2.4.1 标准曲线与灵敏度 在设定的免疫反应和发光条件下 , 以标准血清的浓度（0100 mIU/L）制作的标准曲线见图 3。同时测定 20 个零标准, 用零标准均值加上 2 倍标准差, 计算出此方法的灵敏度为 0.0788 mIU/L。图 3 TSH 标准曲线（略）2.4.2 精密度 取低(4.44 mIU/L)、 中(19.45 mIU/L)和高(79.23 mIU/L)3 种 TSH 浓度各重复测定 10 次, 测定批内 CV 分别为 6.2%、 3.3%和 4.6%, 平均为 4.7%。隔日分别进行 5 次独
9、立试验, 测批间 CV 分别为 8.3%、 7.6%和 9.3%, 平均为 8.4%。2.4.3 准确性 在已知 TSH 浓度的血清中加入 3 种不同浓度的标准血清,测定加入回收率为 93.05%。将 TSH 浓度为 44.42 mIU/L 的血清用标准零血清分别按 1/2、 1/4、 1/8、 1/16 稀释, 测量各稀释浓度的 TSH 含量, 测定稀释回收率为 99.86%。2.4.4 特异性 在已知浓度的血清样品中加入不同浓度的LH、 FSH 和 HCG 后, 对 TSH 的测定无干扰。62.4.5 与进口试剂的比较 将研制的 TSH CLIA 定量检测试剂盒与 Abbott archi
10、tect i2000 全自动化学发光系统共同对 30 例正常人、 20 例甲亢及 80 例甲低临床标本进行检测, 通过数据分析, 得出两个检测系统所得数值具有明显相关性(图 4)。图 4 与 Abbott 全自动化学发光系统相关性曲线（略）3 讨论血清促甲状腺素定量检测的方法主要有放射免疫法、 酶联免疫法、 时间分辨荧光免疫法和化学发光免疫法等几种4 。考虑到目前化学发光和时间分辨荧光分析仪器几乎全部为国外厂商生产, 而绝大多数厂商采用仪器加试剂盒捆绑销售的垄断模式, 并在仪器中人为设置排它性检测程序, 从而抬高了配套试剂盒价格, 增加了检测成本, 所以本工作旨在开发国产低价、 稳定、 通用的
11、人血 TSH CLIA 试剂盒。首先对读数时间进行了动力学研究, 发现其在 515 min 内 RLU 处于平台期 ,反应时间选择 10 min。其次对反应条件进行了实验摸索, 在不同的温育时间和加样量的条件下, 各 RLU 值相差不大, 因此选择了 50 L 的加样量与两步共 1 h 的反应时间。我们研制的 TSH 化学发光免疫测定试剂盒通过方法学鉴定表7明无论是灵敏度、 准确性、 特异性等技术指标均达到了临床诊断的要求5; 同时该方法具有操作方便, 反应时间短和成本低等优点, 具有较广阔的市场应用前景。【参考文献】1 Hay ID, Bayer MF, Kaplan MM, et al.
12、American thyroid association assessment of current free thyroid hormone and thyrotropin measurements and guidelines for future clinical assaysJ. Clin Chem, 1991, 37(11): 2002-2008.2 尹东光, 贺佑丰, 刘一兵, 等. 促甲状腺激素化学发光免疫分析的研究J. 分析化学研究报告 , 2004, 7（32 ）: 893-896.3 叶成果. 促黄体生成素化学发光免疫定量检测试剂盒的研制J. 河南科技大学学报 , 2004, 22（2 ）: 83-84.4 任均田. 促甲状腺素实验检测进展 J. 国外医学放射医学核医学分册, 2002, 26（2）: 57-60.5 王永宁, 李荣秀, 李成武, 等. 微粒子化学发光免疫测定促甲状腺素敏感性方法的建立和应用J. 细胞与分子免疫学杂志, 2004, 20（ 5）: 629-631.8
