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1、1体外微团培养兔骨髓间充质干细胞形成软骨细胞作者：李斌张伟王健孙水吴帅【摘要 】 目的探讨兔骨髓间充质干细胞（bone mesenchymal stem cells，BMSCs ）体外诱导形成软骨细胞的方法，以及转化生长因子-1（transforming growth factor 1，TGF-1） 、胰岛素样生长因子-(insulin-like growth factor-，IGF-)和碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor ，bFGF)之间的相互作用。 方法对兔骨髓间充质干细胞体外进行原代和传代培养，按加入诱导条件不同分为四组：A 组：TGF-
2、1+ bFGF；B 组：TGF-1+ IGF-；C 组：TGF-1；D 组：空白对照组。3 周后分别做四唑盐（ methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）比色试验、糖胺聚糖（glycosaminoglycan，GAG）检测和免疫组织化学染色。 结果A、B 、C 三组型胶原免疫组织化学检测阳性；MTT 吸光度值和GAG 含量检测结果均为：A 组C 组D 组， B 组C 组D 组，统计学有显著差异。 结论兔 BMSCs 在一定条件下可以诱导成软骨细胞，TGF-1 和 IGF-、bFGF 在 BMSCs 向软骨细胞分化和增殖时起协同作用。 【关键词】 骨髓间充质干细胞 软骨细
3、胞转化生长因子-1 2胰岛素样生长因子-碱性成纤维细胞生长因子Abstract: ObjectiveTo study the methods of inducing bone mesenchymal stem cells（BMSCs）of rabbits into chondrocytes in vitro and the interaction of transforming growth factor 1（TGF-1）, insulin-like growth factor-（IGF-) and basic fibroblast growth factor （bFGF). MethodsB
4、MSCs of rabbits were primarily cultured and subcultured in vitro, and then divided into four groups according to the difference of factors: group A receiving TGF-1 and bFGF; group B receiving TGF-1 and IGF-; group C receiving TGF-1; group D receiving no cell growth factor. After three weeks all the
5、four groups were detected by methyl thiazolyl tetrazolium（MTT ） assay,measurement of glycosaminoglycan (GAG) and immunohistochemistry. ResultsImmunohistochemical detection of collagen was positive in groups A, B and C.The results of the MTT assay and the GAG content in groups A and B were obviously
6、higher than those in groups C and D.ConclusionRabbit BMSCs can be induced into chondrocytes under certain conditions.TGF-1, IGF- and bFGF have synergy effect in the differentiation from BMSCs into chondrocytes.3Key words：bone mesenchymal stem cells; chondrocytes; transforming growth factor-1; insuli
7、n-like growth factor-; basic fibroblast growth factor由于软骨内没有血管，成熟软骨细胞有丝分裂能力低下等原因，软骨的自我修复能力非常有限，所以由创伤和退变等所引起的关节软骨损伤成了临床上无法解决的难题。在传统的关节软骨钻孔、自体软骨膜、骨膜移植和自体的骨软骨移植都没有取得良好效果的情况下，组织工程为关节软骨损伤的修复带来了一线曙光。骨髓间充质干细胞（bone mesenchymal stem cells，BMSCs）取材简单，体外增殖能力强，并且具有多向分化潜能，成为了软骨组织工程理想的种子细胞。本研究旨在探讨骨髓间充质干细胞体外向软骨细胞分
8、化的条件以及转化生长因子-1（transforming growth factor 1，TGF-1） 、胰岛素样生长因子-(insulin-like growth factor-，IGF-)和碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor ，bFGF) 之间的相互作用。1 材料与方法1.1 实验材料41.1.1 实验动物为健康新西兰大白兔，雌雄不限，23 个月龄，体重 2.03.0 kg，由山东省农科院提供。1.1.2 实验试剂TGF-1、IGF-和 bFGF 均购自 Peprotech 公司；密度为1.131 g/ml 的 Percoll 分离原液购自
9、Sigma 公司；Dulbeccos Modified Eagle Media (DMEM)购自 Hyclone 公司；胎牛血清购自杭州四季青公司；胰蛋白酶购自华美生物制品公司；型胶原免疫组化试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。1.1.3 实验器材 培养板和培养瓶：Hyclone 公司；CO2 恒温培养箱：美国Nuaire 公司；倒置显微镜：日本 Olympus 公司；超净工作台：苏州净化设备公司；离心机：北京医用离心机厂；分光光度计：Duseries600，USA ；酶联标记检测仪： Multiskan MS，芬兰。1.2 实验方法1.2.1 兔 BMSCs 的体外分离和培养5取 23 个
10、月龄健康新西兰大白兔麻醉毕，无菌条件下穿刺髂骨成功后接上 10 ml 空针，内含 3 000 U/ml 的肝素 0.4 ml，抽取骨髓 68 ml。将肝素骨髓与等体积的 D-hanks 液混合，洗涤去除脂肪。经 1.073 g/ml 的 Percoll 分离液密度梯度离心后（2 500 r/min,20 min）, 吸取单个核细胞层，D-hanks 洗涤后收集细胞，接种到含有完全培养基 4 ml（低糖 DMEM、10%胎牛血清、青霉素钠 100 U/ml、链霉素 100 g/ml）的培养瓶中，置于 37 、饱和湿度、5%CO2 的培养箱中培养。3 d 后半量换液，以后每 3 d 全量换液一次。
11、培养的原代细胞 1214 d 铺满瓶底，用 0.25%的胰酶消化，1 000 r/min 离心 6 min，收集细胞，按 13 的比例传代，命名为 P1。P1 传代细胞培养到铺满瓶底时消化、收集细胞再进行传代培养，命名为 P2。1.2.2 兔 BMSCs 的高密度微团诱导培养和分组P2 传代细胞长满瓶底时，消化、收集细胞，用高糖 DMEM悬浮，调整细胞浓度为 1106/ml。在每个 60 mm 培养皿中各分布 6 滴细胞悬液，每滴 100 l，在 37、饱和湿度、5%CO2 的培养箱中静置 2 h 后再缓慢加入诱导液。按加入诱导液的不同分为四组：A 组：TGF-110 ng/ml+bFGF10
12、 ng/ml；B 组：TGF-110 ng/ml+IGF-10 ng/ml；C 组：TGF-110 ng/ml ；D 组：空白对照组。四组均加入地塞米松 10-7 mmol/ml，VitC 50 g/ml，6含 10%胎牛血清的高糖 DMEM。每 3 d 换液 1 次，共培养 14 d。1.2.3 四唑盐（ methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）比色试验检测细胞增殖率将四组加入不同诱导液的 BMSCs 培养 14 d，胰酶消化，收集细胞并调整细胞浓度为 1104 /ml，接种于 96 孔板，每组 5 孔，每孔 200 l，再加入各组不同的诱导液 200 l。3 d
13、换液 1 次， 7 d 后每孔加入 200 l MTT，培养 4 h，弃上清液，每孔加入 150 l二甲基亚枫，震荡 10 min，用酶联标记检测仪 490 nm 波长测定吸光度值。1.2.4 糖胺聚糖（glycosaminoglycan，GAG）含量检测将四组加入不同诱导液的 BMSCs 培养 14 d，胰酶消化，收集细胞并调整细胞浓度为 1104 /ml，接种于 96 孔板，每组 5 孔，每孔 200 l，再加入各组不同的的诱导液 200 l。3 d 换液 1 次，7 d 后取上清液，以硫酸软骨素为标准品，紫外分光光度计制作标准曲线，阿利新蓝法检测上清液中 GAG 含量。1.2.5 型胶原
14、免疫组织化学检测7将四组加入不同诱导液的 BMSCs 诱导 14 d 后，胰酶消化，收集细胞并调整细胞浓度为 1105/ml，接种于 24 孔板（每孔底部已加入预处理过的细胞爬片）中，每组 5 孔，每孔 400 l，继续培养 7 d，弃上清液，取出载玻片做免疫组化：甲醛室温固定 2030 min，PBS（pH 7.27.6）洗涤一遍；0.1%TritonX-100 破膜 40 min，PBS（pH 7.27.6 ）冲洗一遍； 3%H2O2 室温浸泡 10 min，PBS（pH 7.27.6）冲洗 5 min3 次；加入封闭用正常山羊血清工作液浸泡细胞 10 min，加一抗前吸除；添加稀释的一抗
15、（兔抗人型胶原抗体 IgG）,4过夜，3730 min 复苏，PBS（pH 7.27.6）冲洗 5 min3 次；滴加二抗（生物化山羊抗兔 IgG）, 37固定 10 min，PBS（pH 7.27.6）冲洗 5 min3次；滴加试剂 S-A/HRP，37 10 min，PBS （pH 7.27.6）洗5 min3 次；DAB 显色；苏木素轻度复染，自来水冲洗干净；酒精分化，返蓝，脱水，晾干封片。结果观察： BMSCs 定向分化为软骨细胞的阳性表现为细胞浆内棕黄色细密颗粒，光镜下 BMSCs 细胞的胞浆染成黄色或棕黄色为阳性信号，在 2010 视野下，每张爬片随机取 6 个视野计算阳性细胞数，
16、并以 x-s 表示。1.2.6 统计学方法采用 SPSS 13.0 统计软件包，单因素方差分析，数值以 x-s表示，以 P0.05 表示差异有显著性意义。82 结果2.1 细胞形态学变化原代细胞培养 24 h 就可见少量细胞贴壁，呈短梭形散在分布。3 d 后贴壁细胞明显增多，多为短梭形或成纤维细胞样，偶有多角形和扁平状的，有小的集落形成（图 1） 。到第 7 d 时，集落明显增大，变多，细胞呈长梭形，随后细胞生长迅速形成明显的克隆，克隆逐渐向四周扩展，集落间相互融合，1214 d 铺满瓶底（图2） 。传代后的细胞不再以集落方式生长，而是均匀分布，呈长梭形，但增殖加快，67 d 就铺满瓶底。高密度的微团培养在倒置相差显微镜下可见 BMSC 在培养皿底部局部密集 ,细胞
