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1、1低氧诱导因子1 在大鼠胶原诱导性关节炎中的表达及与血管生成的关系作者：王雯 陈森洲 徐雅娟 刘菁 陈建宏 钟毓娟【摘要 】 目的 制备牛型胶原诱导性大鼠关节炎(CIA)模型，探讨低氧诱导因子1(HIF1) 、血管内皮生长因子(VEGF)在类风湿关节炎(RA) 组织中的动态表达及其相关性作用。方法 50 只 SD 大鼠，随机分为对照组与模型组。建立 CIA 模型，动态观察各项关节炎活动指标，于造模 21、28、35、42 d 取踝关节行 HE 染色及HIF1、VEGF 免疫组化染色，分析两者在 CIA 中的相关性及与关节炎活动指标、滑膜病理学评分之间的关系。结果 CIA 大鼠关节滑膜层和滑膜下
2、层均表达 HIF1、VEGF ，第 21 天阳性表达量最高，随病程进展，表达逐渐下降，与滑膜病理学评分、滑膜增生评分及血管生成评分呈显著正相关，与炎症浸润评分无明显相关。结论 型胶原可成功诱导大鼠关节炎模型。HIF1 、VEGF 在 RA 组织中的表达,与炎症严重程度呈明显正相关。HIF1 可能通过调控一系列下游靶基因，如 VEGF 等，促进滑膜增生及血管生成，影响 RA的发生、发展。 【关键词】 型胶原诱导性关节炎;低氧诱导因子1; 血管内皮生长因子;滑膜2【Abstract】 Objective To establish the bovine collagen(C)induced arth
3、ritis (CIA) rat model and investigate the role of hypoxiainducible factor1(HIF1) and vascular endothelial growth factor (VEGF) in the pathogenesis of rheumatoid arthritis (RA). Methods 50 SD rats were randomly divided into normal and model group. The arthritis activity, pathological changes and expr
4、ession of HIF1 and VEGF on synovium at different time were observed through HE and immunohistochemistry staining. The correlations of HIF1 and VEGF expression with the CIA arthritis activity indexes and pathological scores were analyzed. Results HIF1 and VEGF expressions were found on both lining an
5、d sublining area of synovium in CIA. The results of immunohistochemistry test showed that the expression of HIF1 and VEGF in synovial membrane was strongest on the 21st day, descent gradually with the prolonged disease course. The expression of HIF1 and VEGF correlated significantly with total patho
6、logical score, synovial hyperplasia score and angiogenesis score, but not with inflammation score. Conclusions Type collagen can induce arthritis in rats successfully. HIF1 may affect the 3pathogenesis of RA by promoting synovial hyperplasia and angiogenesis and regulating the lower course target ge
7、nes just as VEGF.【Key words】 Rheumatoid arthritis; Collagen induced arthritis; Hypoxiainducible factor1 ; Vascular endothelial growth factor; Synovium类风湿关节炎(RA)是一种以慢性、对称性、多关节炎症为主要表现的自身免疫性疾病，其病因和发病机制迄今尚未明确。RA 主要病理改变为滑膜炎，滑膜细胞的类肿瘤样增殖和大量炎症细胞的浸润，造成一个低氧微环境。低氧诱导因子1(HIF1) 是介导细胞对缺氧微环境适应反应的关键性调控因子。研究发现，有核细胞缺氧
8、时，均可引发 HIF1 的高表达1 。新生血管形成是造成滑膜炎、血管翳、关节破坏发生发展的一个重要环节，血管内皮生长因子(VEGF) 是目前发现的最强有力促血管生成因子，直接参与新生血管形成。在 RA 中 VEGF 能够促进滑膜血管翳的形成、加重滑膜炎症及骨与关节软骨的破坏。本实验以大鼠型胶原诱导性关节炎(collagen induced arthritis,CIA)为模型，研究 HIF1 在 CIA中的表达及与新生血管生成之间的关系，初步探讨 HIF1 在 RA发病过程中的作用及与 VEGF 之间的关系，有助于了解 HIF1 对于 RA 发生发展的调控作用。41 材料与方法1.1 实验动物和
9、试剂 雌雄各半健康 SD 大鼠 50 只( 体重150 180 g)，动物级别：清洁级 (SPF)，由本院动物中心提供，动物许可证号：SCXK 桂 20070001，购入本实验室适应性饲养 1 w后进行实验。随机分为正常对照组，四个造模组，每组按照随机方式 110 进行编号。牛型胶原(美国 Chondrex 公司);不完全弗氏佐剂(IFA ，美国 Sigma 公司);HIF1 单克隆抗体(美国 Chemicon公司);VEGF 单克隆抗体(美国 Santa Cruz 公司);二抗试剂盒(福州迈新公司)。1.2 动物模型及关节标本制作 按照文献提供的方法稍加修改建立型胶原诱导型关节炎大鼠模型2
10、，牛 型胶原和 IFA 按11 充分乳化成终浓度为 1 g/L 乳剂。分 45 点在大鼠尾根部、背部皮内注射 0.5 ml，对照组注射同量生理盐水，7 d 后同法半量加强免疫一次。四个造模组大鼠分别于初次免疫后第 21 天、第 28天、第 35 天、第 42 天处死; 对照组大鼠于注射生理盐水后第 42 天处死。处死后大鼠取踝关节，乙二胺二乙酸(EDTA)脱钙 23 w 后，石蜡包埋、切片，行 HE 染色，SP 免疫组织化学法检测HIF1、VEGF 蛋白的表达。51.3 观察指标1.3.1 大鼠一般状况及体重测定 造模前后动态观察大鼠体重、毛发色泽改变、神志、活动状态，食量变化及关节红肿情况，
11、每周定期测量大鼠体重。1.3.2 关节炎指数3(AI) 根据大鼠踝关节、跖趾关节、趾关节红肿程度及受影响关节数进行评分。0 分：正常;1 分：1 个关节红肿;2 分：2 个及 2 个以上关节红肿;3 分：踝关节以下足掌严重红肿;4 分：包括踝关节在内的全部足爪红肿且不能负重。四肢分别进行评分，总和即为 AI。AI5 分为造模成功。1.3.3 踝关节影像学观察 初次免疫后第 21 天、第 42 天经 1%戊巴比妥钠麻醉大鼠后，行踝关节 X 线摄片。摄片条件为 40 kV。1.3.4 免疫组织化学染色结果判定及评分 采用半定量记分法判定：按阳性着色程度评分。0 分为无着色，与背景色一致 ;1 分为
12、浅黄色，略高于背景色;2 分为棕黄色，明显高于背景色 ;3 分为棕褐色。按阳性细胞所占比例评分。0 分为阴性 ;1 分为 10%以下;2分为 11%50%;3 分为 51%75%;4 分为 75%以上。两者乘积判定阳性结果。HIF1 阳性细胞为胞浆或胞核呈棕黄色或棕褐色，VEGF 阳性细胞为胞浆呈棕黄色或棕褐色。61.4 统计学处理 采用 SPSS13.0 统计软件进行处理，正态分布资料用 xs 表示;多组间均数的比较采用单因素方差分析 ;半定量资料两组间比较采用 MannWhitney 秩和检验;对两组数据间的相关性进行 Spearman 等级相关分析。2 结 果2.1 大鼠 CIA 模型的
13、建立 模型组 40 只大鼠在首次给药后第12 天起，有 26 只出现踝、跖趾关节以及趾关节红肿。对照组未出现明显关节红肿。造模成功率为 65%(26/40)。2.2 一般情况 造模期间动物无死亡 ,对照组大鼠体重逐渐增加、精神良好、活动自如。模型组给药 12 d 后开始出现不同程度后足爪红肿、皮温升高、脱毛、精神怠倦、体重增长减慢甚至下降、饮食饮水量下降。给药 48 h 后注射部位出现炎性小溃疡，红肿明显，逐渐加重并破溃，7 10 d 破溃处形成硬痂，而后脱落溃疡愈合。2.3 CIA 大鼠 AI 变化 随着炎症的发展，AI 值逐渐增加。初次免疫 12 d 及以后各时间点 AI 值均与正常组(0
14、.400.52)比较有差异(P0.05)，第 21 天达峰值(10.631.06)，之后第 28、35 天(9.200.84，7.431.13)逐渐下降，第 42 天(6.331.03) 降至最低值，但仍高于正常组(均 P0.05)。正常对照组 AI 值均小于 1。72.4 X 线改变 对照组踝关节软组织无肿胀，骨质无破坏，足趾关节间隙清楚。模型组免疫后第 21 天，踝关节周围软组织肿胀，足趾关节间隙模糊、狭窄及融合等表现。第 42 天踝关节骨骼结构排列紊乱，关节间隙不清，可见囊性骨吸收和骨侵蚀。提示模型组发生慢性侵蚀性关节炎。见图 1。2.5 大鼠踝关节病理学变化 正常大鼠滑膜由 12 层扁
15、平滑膜细胞组成，无炎细胞浸润及血管增生，关节结构完整，软骨层较厚，表面光滑。CIA 组大鼠初次免疫后 21 d 时滑膜细胞层数增至1015 层，增生滑膜形成血管翳，炎细胞浸润;42 d 侵蚀软骨及骨，关节软骨可见坏死脱落、纤维化，广泛炎细胞浸润，伴有不同程度的软组织水肿，滑膜下层大量纤维增生及新生血管形成，呈肿瘤性侵袭性生长。见图 2。2.6 CIA 大鼠滑膜 HIF1、VEGF 蛋白的表达 正常对照组均未见 HIF1、VEGF 蛋白表达。CIA 模型组 HIF1、VEGF 表达增强，HIF1 在细胞核及细胞质中均表达，VEGF 表达于细胞浆中。从免疫组化结果可以看出不仅滑膜细胞，滑膜下层巨噬
16、细胞、部分血管内皮细胞、成纤维细胞等也表达HIF1、VEGF 。HIF1 表达与 AI 呈正相关(r=0.725， P0.01)， HIF1 与 VEGF 蛋白表达情况进行相关8回归分析，呈明显正相关(r=0.75，P0.01)。两者均在第 21 天、第 28 天滑膜细胞阳性表达量及程度最高，随病程进展，阳性表达量及程度逐渐下降。见图 3，表 2。图 1 大鼠踝关节 X 线检查 图 2 大鼠踝关节腔病理学变化 HE 染色图 3 模型组关节滑膜组织HIF1 和 VEGF 表达 (DAB，400)表 2 各组大鼠滑膜HIF1、VEGF 蛋白表达的免疫组化评分3 讨 论CIA 是目前用于研究 RA 较为理想的动物模型，其免疫机制、关节病理改变、临床表现和实验室指标与人类
