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1、1T 细胞在变应原雾化吸入减敏防治过敏性支气管哮喘中的作用作者：姜晓红, 李超乾*, 何英, 邓家珍, 覃惠清, 梁国容【摘要 】 目的: 探讨 T 细胞在过敏性支气管哮喘发病机制中的作用。方法: 来自门诊的 40 例粉尘螨和屋尘螨点刺阳性、 部分控制过敏性支气管哮喘患者随机分为常规治疗组(A 组)和吸入减敏组（B 组）, 每组各 20 例。所有患者接受相同的基础治疗, 常规治疗组雾化吸入生理盐水 5 mL、 吸入减敏组雾化吸入特异性变应原, 每周 2 次, 持续 6 个月。治疗前后用流式细胞术（FCM）检测外周血及诱导痰中 T 细胞占淋巴细胞百分比 ; IL4+、 IFN+T细胞占淋巴细胞百
2、分比。结果: 治疗后 B 组外周血、 诱导痰中 T细胞占淋巴细胞百分比低于治疗前; B 组外周血和诱导痰中IFN+T 细胞占淋巴细胞百分比增高。结论: 特异性变应原雾化吸入减敏疗法有效防治哮喘可能与 T 细胞有关 ; T 细胞可能参与哮喘发病机制。 【关键词】 减敏 哮喘 T 细胞 IL 4 IFN Abstract AIM: To explore the role of T cells in the pathogenesis of allergic bronchial asthma. METHODS: Forty 2patients with Der.p and Der f allergy
3、and partlycontrolled asthma were involved in a random study. Besides the fact that all patients were treated with same basic treatment. Patients in group A were nebulized with 5 mL normal saline while group B with specific allergen twice a week for six months. The percentage of T cells in peripheral
4、 blood and induced sputum and the percentage of IL4+ and IFN+ T cells were detected by flow cytometry(FCM) before and after treatment. RESULTS: The percentage of T cells in group B decreased after treatment, and the percentage of IFN+ T cells in both peripheral blood and induced sputum increased sig
5、nificantly in group B than that in group A. CONCLUSION: T cells, which may participate in the pathogenesis of bronchial asthma, may contribute to the prevention and treatment of bronchial asthma by desensitization of allergen nebulization.Keywordshyposensitization; asthma; gamma/delta T cells; inter
6、leukin4; interferon支气管哮喘是呼吸道常见疾病, 其病因和发病机制相当复杂, 给临床防治带来一定的困难。特异性变应原免疫疗法是惟一针对哮3喘病因的治疗方法, 自 20 世纪 80 年代以来, 由于抗原进一步提纯标化, 注射方法规范化, 免疫减敏疗法进一步被肯定1 。变应原雾化吸入减敏疗法是改变减敏途径的新的免疫疗法, 李超乾等2 在大鼠哮喘模型中成功进行了特异性变应原雾化吸入减敏, 并发现其与皮下减敏有着相类似的细胞、 分子机制, 提示该方法应用于临床的良好基础、 前提和可行性。T 细胞是哮喘发病机制中的重要细胞。我们主要探讨特异性变应原雾化吸入减敏疗法对过敏性支气管哮喘的防
7、治作用及与 T 细胞的关系。1 材料和方法1.1 材料 PEantihuman IL4、 PEantihuman IFN、 FITCantihuman TCR gamma delta 及同型对照均购自美国 Ebioscience 公司。Intraprep 透膜剂、 PECY5antihuman CD45 购自美国 Backmancoulter 公司。Ionnmycin、 Monensin、 PMA、 BFA 为美国 Sigma 公司产品。阿罗格点刺液及阿罗格变应原购自德国默克阿罗格制药有限公司。KCW1S 型超声雾化器购自南通杰西电器有限责任公司。MasterScope 肺功能检测仪购自德国耶
8、格公司。流式细胞仪为美国Backmancoulter 公司产品。1.2 方法41.2.1 实验分组 根据 GINA 哮喘诊断标准, 确诊为部分控制, 皮肤过敏原测试粉尘螨、 屋尘螨阳性的门诊哮喘患者 40 例, 其中男 23 例, 女 17 例, 年龄 1647(33.548.56)岁, 无心、 肝或肾疾患, 近期无感染史, 治疗前 3 个月未使用过激素和免疫调节剂。随机分为 A（常规治疗组） 、 B（吸入减敏组） 2 组, 每组各 20 例。1.2.2 变应原的配制 在无菌条件下, 用力将浓度 3 级液摇匀, 吸取 0.5 mL, 加入到装有 4.5 mL 溶媒的瓶子中, 摇匀, 稀释后立即
9、写上“浓度 2 级” 、 患者的姓名、 及稀释时间。以此类推 , 分别配制“浓度 1 级” 、 “浓度 0 级” 、 “浓度1 级” 、 “浓度 2 级” 、 “浓度 3 级”液, 于 4 保存备用。1.2.3 基础治疗 评价患者临床综合指标, 填写支气管哮喘病情调查表及知情同意书 。所有患者接受相同的基础治疗, 吸入替卡松/沙美特罗 50/100 g（商品名: 舒利迭, 含氟替卡松和沙美特罗 2 种成分, 葛兰素史克公司）, 2 次/d。按需吸入短效 2 受体激动剂（商品名: 喘乐宁, 每揿 100 g, 葛兰素威康公司）两喷。1.2.4 分组治疗 A 组雾化吸入生理盐水 5 mL 每周 2
10、 次, 持续 6 个月。B 组雾化吸入特异性变应原, 起始浓度以皮试强度而决5定: 皮试强度+, 起始浓度 1 级; 皮试强度 +, 起始浓度 2 级; 皮试强度+, 起始浓度 -3 级。以起始浓度的第一个最小剂量 0.05 mL+5 mL 生理盐水雾化吸入, 雾化结束后观察 30 min。剂量依次递增为 0.05、 0.1、 0.2、 0.4、 0.6 和 0.8 mL 吸入 6 次后再提高一个浓度级进行雾化吸入。注意事项, 常规准备肾上腺素、 地塞米松、 平衡液等急救药品和物品。嘱患者做深慢呼吸, 吸气后屏气, 以助于雾化颗粒沉积于下气道和肺泡。严格遵循雾化吸入间隔时间, 如果吸入时发生气
11、紧、 咳嗽、 咽痒等症状, 立即停止本次治疗, 下次脱敏变应原浓度降低。患者在治疗当天要避免体力活动（避免饮酒、 热水浴等） 。1.2.5 诱导痰及痰标本的制作 用高渗盐水诱导痰, 其具体操作步骤采用 Pin 改良法3, 收集足量痰液于刻度离心管, 用吸管去黏液、 唾液、 分泌物后, 加入 4 倍体积 1 g/L 的 DTT(二硫苏糖醇), 用吸管轻轻吹打均匀, 37水浴 15 min、 每隔 5 min 轻微搅拌 1次形成细胞悬液, 用 200 目铜网过滤痰液以除去杂物 , 以 1200 r/min 离心 7 min, 离心弃上清后加入 PBS 液 500 L, 余与下同。1.2.6 淋巴细
12、胞的活化 取枸椽酸钠抗凝的外周血 2 mL, 室温放置。取 500 L 抗凝血（痰标本）, 加入 500 L 含 PMA（25L） 、Ionomycin (20L)、 BFA（20L ） 、 Monensin(1.7L)、 含胎牛血清的 RPMI1640 培养液,混匀。37、 50 mL/L CO2 培养箱6培养 4 h。1.2.7 诱导痰及外周血中 T 细胞占淋巴细胞百分比及IL4+、 IFN+T 细胞占淋巴细胞百分比测定 将经淋巴细胞活化的外周血和诱导痰标本分 A、 B、 C3 管, 每管 100 L, 均加入PECY5antihuman CD4510 L, A 管加 FITCIgG120
13、 L, B、 C 管加入 FITCantihumanTCR 20 L、 室温暗处孵育 20 min, 3 管均加入 Intraprep#1100 L、 室温暗处孵育 15min 后, 加入 PBS 液 4mL, 1500 r/min, 离心 5min, 弃上清, 加入Intraprep#2100 L, 室温暗处孵育 5 min, A 管加入 PEIgG110 L、 B、 C 管分别加入 PEantihumanIL4、 PEantihumanIFN 各 5 L, 室温暗处孵育 20 min, 均加入PBS 液 4 mL, 1500 r/min, 离心 5 min, 弃上清, 溶血机溶血（痰标本中
14、加入 PBS 液 500 L） 。1.2.8 FCM 检测 打开细胞仪及氩离子激光光源（ 488 nm）, 预热 20 min, 仪器自动初始化, 用标准荧光微球进行光路与流路校准, 所有荧光信号的变异系数（CV ）均2%, 在侧向散射光(SS)为纵坐标, CD45PCY5 为横坐标的二维散点图中设门选定 CD45 阳性淋巴细胞, 分别用 T 和 IL4 及 T 和 IFN 建立单参数直方图对 CD45 设门选定的淋巴细胞进行分析, 得出 CD45+T 细胞百分比, IL4+T 细胞、 IFN+T 细胞的百分比。全部数据经流7式细胞仪的 SYSTEM软件获取和分析。1.2.9 统计学处理 应用
15、 SPSS10.0 统计软件包进行分析。治疗前、 后比较采用配对 t 检验, 两组 T 细胞优势表达比较采用2 检验, P0.05 为有统计学意义。2 结果2.1 诱导痰及外周血中 T 细胞占淋巴细胞百分比测定结果 治疗后 B 组外周血和诱导痰中 T 细胞占淋巴细胞百分比低于治疗前（表 1） 。表 1 治疗前后两组 T 细胞占淋巴细胞百分比（略）Tab 1 Percentage of T cells in lymphocytes after therapy and beforeaP0.05, bP0.01 vs before therapy.2.2 诱导痰及外周血中 IL4+、 IFN+T 细胞占淋巴细胞百分比测定结果 IL4+T 细胞代表 Th2 优势, IFN+T 细胞代表 Th1 优势, 治疗后 B 组外周血及诱导痰中 T 细胞表现为Th1 优势表达 , 两组比较有统计学意义（表 2） 。8表 2 治疗后两组 T 细胞优势表达比较（略）Tab 2 The dominance of T cells after therapyaP0.05, bP0.01 vs group A.3 讨论支气管哮喘目前尚不能根治, 但经过系统、 规范的治疗, 可达到良好的控制4。对于过敏性支气管
