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1、1T7 噬菌体衣壳蛋白 P11 的原核表达、 纯化及其单克隆抗体的制备【摘要】 目的: 表达、 纯化 T7 噬菌体衣壳蛋白 P11, 并制备其单克隆抗体（mAb） 。方法: 克隆并表达 T7 噬菌体 P11 蛋白, 其氨基端带有 6His 标签。纯化后的蛋白免疫 BALB/c 小鼠, 经融合、 筛选制备特异性 mAb。结果: 成功表达了 P11 蛋白。SDSPAGE 显示所表达蛋白的相对分子质量（Mr）约为 27 000。获得了 1 株稳定分泌抗 P11 抗体的杂交瘤细胞株（2G11）, 其分泌的 mAb 的 Ig亚类（型）为 IgG2b。ELISA 检测, 对应腹水 mAb 的效价为18.1
2、105。Western blot 结果显示抗 P11mAb 具有良好的特异性。结论: 成功地制备了 P11 蛋白及其 mAb。 【关键词】 T7 噬菌体 P11 蛋白 核表达 单克隆抗体T7 噬菌体是一种感染大肠杆菌的烈性噬菌体1 , 基因组为线状双链 DNA, 长 39 936 bp。其衣壳蛋白包括主要头蛋白 PlOA、 次要头蛋白 P1OB、颈圈蛋白 P8、尾蛋白 P11、P12 和尾丝蛋白P172, 3 。T7 噬菌体作为一种常见的展示系统4-6, 因其载体容量大, 插入片段稳定, 洗涤条件灵活, 生长周期短而被广泛使用。为进一步研究 T7 噬菌体尾蛋白 P11 蛋白结构和功能, 并为建
3、立 T7噬菌体快速准确的检测方法奠定基础, 我们进行了原核表达、 纯化2P11 蛋白并制备出具有良好特异性的 mAb。1 材料和方法1.1 材料质粒 pET28a(+)、T7 select 103b control, 大肠杆菌Top10 株, 大肠杆菌 BL21（DE3）以及 Sp2/0 细胞均由本室保存。限制性内切酶 Nde 和 BamH 均购自大连宝生物公司。胶回收试剂盒购自华舜生物工程有限公司。NiNTA HisBind resin 购自Amersham 公司。HRP羊抗鼠 IgG 和 Ig 亚类（型）鉴定试剂盒 Sigma 公司产品。BALB/c 小鼠由本研究所实验动物中心提供。1.2
4、 方法1.2.1 重组原核表达载体的构建以 T7 select 103b control 质粒为模板 , 加入针对 G11 基因的特异引物进行 PCR 扩增。上游引物为: 5ggaattccatatgatgcgctcatacgatatgaac3（划线处为 Nde I 酶3切位点）下游引物为: 5cgggatccttagcgagtcagtagaccag3（划线处为 BamH I 酶切位点） 。扩增反应的条件为 : 94 变性 5 min, 然后进行 30 个循环: 94 30 s, 58 45 s, 72 60 s, 最后 72 延伸 8 min。用胶回收试剂盒纯化 PCR 产物, 用 Nde
5、I 和 BamH I 双酶切 PCR 产物和 pET28a(+), T4 DNA 连接酶连接并转化大肠杆菌 Top10 株 , 抽取质粒, Nde I 和 BamH I 双酶切鉴定并测序确认正确, 成功构建重组表达载体 pET28a(+)/G11。1.2.2 重组 P11 蛋白的表达及纯化将 pET28a(+)/G11 转化大肠杆菌 BL21(DE3)。用异丙基D硫代半乳糖苷（IPTG）分别诱导表达 4、 6、 8 h, 通过SDSPAGE 分析比较诱导前后结果。挑单克隆接种于含 50 mg/L卡那霉素的 LB 培养基中, 37震荡培养过夜, 按 1100 转接到200 mL 培养基中 , 3
6、7培养至 A600 为 0.6 时, 加入 IPTG 至终浓度为 0.4 mmol/L, 30诱导表达 4 h。收集菌液 , 以 8 000 r/min离心 10 min 收集菌体 , 用缓冲液 A（pH7.4 、 20 mmol/L PB、 0.5 mol/L NaCl、 1 mmol/L PMSF）重悬细菌沉淀, 经超声破碎细菌后, 以 12 000 r/min 离心 10 min。取上清, 采用 DuoFlow系统（BioRad ）NiNTA 亲和柱层析, 缓冲液 B（pH7.4、 20 mmol/L PB、 0.5 mol/L NaCl、 0.5 mol/L imidazole）梯度洗
7、脱。收集洗脱峰, 120 g/L SDSPAGE 鉴定纯化效果。41.2.3 动物免疫用 400 L 纯化的 p11 蛋白（1.0 g/L）稀释于 6 000 L PBS（0.1 mol/L PB、 0.15 mol/L NaCl）并与等量完全弗氏佐剂混合充分乳化, 多点皮下注射免疫 BALB/c 小鼠（50 g/只） 。1 个月后, 经腹腔注射加强免疫, 用不完全弗氏佐剂充分乳化抗原, 注射剂量同前, 后每隔 2 周分别进行第 3 次和第 4 次加强免疫。1.2.4 细胞融合与抗体制备ELISA 法检测抗血清的效价 , 取效价最高的老鼠, 脾内注射10 g 抗原加强免疫, 4 d 后, 取脾
8、细胞与骨髓瘤细胞 Sp2/0 融合7 。用间接 ELISA 法8筛选阳性杂交瘤细胞株。经 3 次有限稀释法克隆化后, 选择 1 株 mAb 持续分泌阳性的杂交瘤细胞并扩大培养准备腹腔注射小鼠。接种杂交瘤细胞前 1 周, 小鼠腹腔注射 0.5 mL 液体石蜡。接种时离心收集杂交瘤细胞, 用不完全培养液悬浮并混匀, 将细胞数调至 (12) 109/L, 每只小鼠腹腔注射 0.5 mL, 1周后小鼠腹部明显肿胀, 消毒下腹部皮肤后, 抽取腹水, 获得腹水经3 000 r/min 离心 15 min, 收集上清。硫酸铵法初步纯化腹水, 以用于后续检测。51.2.5 mAb 的效价和亚类鉴定效价测定:
9、采用间接 ELISA 法。用 PBS 稀释 10 L P11 蛋白（1 mg/L）包被聚苯乙烯板。一抗为稀释的腹水样本, 二抗为11 000 的 HRP羊抗鼠 IgG, 经 ABTS 底物显色后, 于波长 405 nm 测定 A 值。Ig 亚类（型）的鉴定：间接 ELISA 法（参照试剂盒的说明书进行） 。特异性鉴定: Western blot 分析, 纯化后的P11 融合蛋白 SDSPAGE 后, 电转移至硝酸纤维素(NC)膜上, 转移后的 NC 膜于封闭液中封闭过夜后 , 先与抗 P11 的 mAb 反应过夜, 再与 HRP 标记的羊抗鼠 IgG 37孵育 2 h, 经显色液显色后压片观察
10、结果。2 结果2.1 重组质粒的鉴定重组表达质粒 pET28a(+)/G11 经 Nde I 和 BamH I 酶切后分别出现 5927、 598 bp 的电泳条带（图 1）, 与预期大小相符, 测序结果与文献发表的序列一致, 未发现突变碱基存在, 说明重组原核表达载体构建正确。2.2 G11 基因在大肠杆菌 BL21(DE3)中的表达和纯化6将重组表达质粒 pET28a(+)/G11 转化大肠杆菌BL21（DE3）后, 经 IPTG 诱导表达表达 4、6 和 8 h。表达产物经SDSPAGE 后, 在 Mr 约 27000 处可见 1 条明显的蛋白带（图 2） 。该蛋白的氨基端带有 Hist
11、ag, 大量诱导表达 Ni2+柱亲和层析纯化后, 用 BCA 法定量, 可溶性表达蛋白含量为 1.0 mg/L。2.3 抗 P11 蛋白 mAb 的制备和初步鉴定血清抗体效价最高的免疫小鼠的脾细胞进行融合, 结果筛选到 1 株阳性克隆, 命名为 2G11。经 ELISA 检测, 1 株 mAb 腹水的效价为 18.1105。其 Ig 亚类为 IgG2b、 Western blot 结果显示, 在 Mr 为 27 000 处 T7 噬菌体蛋白和重组 P11 蛋白有一明显条带, 而未经诱导菌体蛋白、 P10his 蛋白和 T4 噬菌体蛋白则无此反应（图 3） 。3 讨论本实验中我们构建了原核表达载
12、体 pET28a(+)/G11, 鉴定正确后转化至大肠杆菌 BL21（DE3）表达羧基端含 6His 标签的可溶性融合蛋白。利用 6His 标签和镍离子特异性螯合的特性纯化, 得到高纯度的目的蛋白。以纯化 P11 蛋白为抗原, 通过杂交瘤技术成功获得了抗 P11 的 mAb7。T7 噬菌体具有的强大的外源蛋白或多肽展示能力, 已经被广泛应用于 cDNA 文库展示 , 如最近就有人利用 T7 噬菌体展示前列腺癌组织的 cDNA 文库 9, 然后利用文库技术与噬菌体芯片技术结合找到了一些前列腺癌的自身抗原及自身抗体。在实际工作中, 我们发现制备 T7 噬菌体芯片时, 需要对展示不同多肽的噬菌体进行
13、定量检测（未发表资料）, 如果能够首先在芯片上点上抗 T7 噬菌体的抗体, 然后再点上 T7 噬菌体, 那将有望使芯片上的 T7 噬菌体较均一; 而且由于 P11 位于 T7 噬菌体的尾部（图 4）, 这样的点样方式, 也将使融合于 P10 的蛋白或多肽更加有效的展示, 进而使筛选更加有效。此外 , 关于 T7 噬菌体尾蛋白 P11 参与包装的具体过程和机制尚不完全清楚, 还需要更多研究。另外, T7 噬菌体实验室污染已经引起普遍关注, 噬菌斑法是检测噬菌体最常用方法, 其局限性在于不能将其他噬菌体与 T7 噬菌体加以区分。到目前为止, 尚未见制备针对P11mAb 的报道。本实验室首次制作的
14、T7 噬菌体 P11 mAb 为进一步研究 T7 Phage 的结构与功能 , 并为建立 T7 噬菌体快速准确诊断方法奠定基础。【参考文献】81徐晋麟, 徐 沁, 陈 淳. 现代遗传学原理M. 北京: 科学出版社, 2007, 125.2Son M, Serwer P. Role of exonuclease in the specificity of bacteriophage T7 DNA packagingJ. Virology, 1992, 190(2): 824-833.3Cerritelli ME, Studier FW. Assembly of T7 capsids from i
15、ndependentlyexpressed and purified head protein and scafolding proteinJ. J Mol Biol, 1996, 258(2): 286-298.4Smith GP, Petrenko VA. Phage displayJ. Chem Rev, 1997, 97(2): 391-410.5Yu X, Zhao P, Zhang W, et al. Screening of phage displayed human liver cDNA library against dexamethasoneJ. J Pharm Biome
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