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1、1IL15和 TGF对人 PBMC 上 LAIR1表达的调节作用作者：张晓姝, 曹奇志, 王春艳, 张骞, 薛江楠【摘要 】 目的: 研究细胞因子 IL15 和 TGF 对人外周血单个核细胞(PBMC) 上 LAIR1 表达的调节作用。方法 : 以 IL15和 TGF 作用于人 PBMC, 流式细胞术(FCM)检测 PBMC 上白细胞相关免疫球蛋白样受体 1(LAIR1)的表达。结果: 与单独 PHA 刺激组相比, IL15 刺激 72 h 后细胞免疫荧光强度明显减弱（P0.05）, 阳性细胞百分率也有所下降; TGF 刺激的 PBMC上 LAIR1 表达水平也有所降低。 结论: IL15 和
2、 TGF 都可以下调 PHA 活化 PBMC 上 LAIR1 的表达。 【关键词】 外周血单个核细胞 白细胞相关免疫球蛋白样受体 1 IL 15 TGF 流式细胞术澳大利亚的 Burns 等1用人的 NK 细胞免疫小鼠获得 1株单克隆抗体(mAb) 9.1C3, 它能显著抑制人 NK 细胞、 CTL 以及单核细胞的杀伤作用。1999 年鉴定其所识别的分子（9.1C3 分子）为一种免疫细胞抑制性受体, 并进一步证实 9.1C3 分子与美国DNAX 研究所报道的白细胞相关免疫球蛋白样受体 1 2(leukocyteassociated immunoglobulinlike receptor1, L
3、AIR1)以及 Poggi 等报道的 p40 为同一分子2 。2004 年 12月召开的第 8 届国际人类白细胞分化抗原大会组委会（HLDA8）已将 LAIR1/9.1C3 分子正式命名为 CD3053 。LAIR1 是胞质区含有两个 ITIM 模体的跨膜糖蛋白,能募集含有 SH2 的酪氨酸磷酸酶1 和酪氨酸磷酸酶 2(SHP1、 SHP2), 发挥抑制功能4 。LAIR1 广泛表达于白细胞, 包括 NK 细胞、 T 细胞、 B 细胞、 单核/ 巨噬细胞以及 DC 细胞, 提示 LAIR1 分子可能广泛参与免疫应答过程。 本研究中通过流式细胞术(FCM) 探讨了细胞因子 IL15 和TGF 对
4、人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)上 LAIR1 表达的影响作用, 为进一步研究 LAIR1 的功能奠定基础。1 材料和方法1.1 材料 LAIR1 单克隆抗体(mAb)由第四军医大学金伯泉教授惠赠。FITC 标记羊抗鼠 IgG 购自 HBT 公司。淋巴细胞分离液为天津 TBD 公司产品。RPMI1640 培养基为 Gibco 公司产品。小牛血清为杭州四季青公司产品。IL15 和 TGF 购自法国Digclone 公司。PHA 为 Sigma 公司产品。31.2 方法1.2.1 PBMC 分离和培养 无菌抽取 6 个健康人的静脉
5、血各 5 mL, 加肝素 250 U 抗凝。采用 Ficoll密度梯度离心法分离PBMC。洗涤 2 次后加入含有 100 mL/L 胎牛血清的 RPMI1640 重悬细胞, 调至细胞密度 5108/L, 置于 24 孔培养板中, 37、 50 mL/L CO2 孵箱中培养。1.2.2 细胞因子 IL15 和 TGF 对 PBMC 的刺激 实验分为4 组, 每组 3 复孔, 分别加入如下试剂: IL15+PHA; TGF+PHA; 单独 PHA; 无 PHA 和细胞因子。其中 IL15 和 TGF 的用量为20 g/L, PHA 为 50 mg/L。1.2.3 FCM 分析 PBMC 上 LAI
6、R1 的表达 将培养不同时间点的 PBMC 用含 100 mL/L 胎牛血清的 RPMI1640 调整细胞密度约为 11010/L, 加入特异性 mAb（LAIR1 mAb）, 再加入适量的灭活兔血清, 4 30 min。用洗涤液洗涤 2 次后加入工作浓度的FITC 标记羊抗鼠 IgG（HBT 公司）, 充分振摇, 4 30 min。用洗涤液洗涤 2 次后加适量固定液 , 应用 FCM 进行检测。1.2.4 统计学处理 应用统计学软件 SPSS13.0 进行分析。多4样本均数的两两比较（LSD）采用方差分析（ ANOVA） 。P0.05为具有统计学意义。2 结果2.1 PBMC 上 LAIR1
7、 的表达 阳性细胞百分率结果显示PHA 刺激 48 和 72 h 后 LAIR1 在 PBMC 上表达水平高于未刺激组, 刺激 72 h 后 LAIR1 表达水平明显增高（ P0.05） 。刺激 72 h 后细胞的平均免疫荧光强度也有所升高( 图 1)。2.2 IL15 对 PBMC 上 LAIR1 表达的影响作用 加 IL15和 PHA 的一组与加 PHA 的一组相比, 阳性细胞百分率在 72 h 后则下降。而与加 PHA 组相比, IL15 和 PHA 刺激 72 h 后细胞平均免疫荧光强度明显减弱(图 1)。2.3 TGF 对 PBMC 上 LAIR1 表达的影响作用 与加 PHA的一组
8、相比, 经 TGF 和 PHA 共同刺激组阳性细胞百分率在 24 h后略上调, 48 h 后下降 , 72 h 后又有所上调 ; 以及平均免疫荧光强度在 72 h 后均有所下降(图 1)。图 1 IL15 和 TGF 对 PHA 活化 PBMC LAIR1 表达的调节作用（略）5a: 未经刺激的 PBMC 上 LAIR1 的表达 ; b: PHA 刺激的PBMC 上 LAIR1 的表达; c: PHA 和 IL15 共刺激的 PBMC 上LAIR1 的表达; d: PHA 和 TGF 共刺激的 PBMC 上 LAIR1 的表达.3 讨论LAIR1 是一种免疫抑制性受体, 体外研究表明, LAI
9、R1 被其相应的 mAb 交联后, 可传递强烈的抑制性信号, 可抑制包括 NK 细胞、 效应 T 细胞、 B 细胞和树突状细胞(DC)前体等多种免疫细胞的功能5 。在 B 细胞、 中性粒细胞和 DC 分化成熟过程中, LAIR1 的表达是受调控的。最近的研究证明, 在人 T 细胞分化过程中, LAIR1 的表达也呈现分化性。与记忆性 T 细胞相比, 初始的CD4+T 细胞、 CD8+T 和效应性 CD8+T 表达更高水平的 LAIR1分子6 。我们在实验中也发现与无刺激组相比, PHA 刺激 72 h 后, PBMC 上 LAIR1 表达水平明显增高（P0.05）, 说明 LAIR1的表达随细
10、胞的增殖和活化而升高, 此现象与 CTLA4 等抑制性受体表达相类似。IL15 主要由单个核细胞和肥大细胞产生7 。它与 IL2具有相似的生物学活性, 可以刺激 NK 细胞和 T 细胞的产生和增殖。6研究证明, IL15 还具有抗肿瘤作用8 。而 TGF 的主要功能是免疫抑制效应, 它可以广泛抑制 T 细胞、 B 细胞和 NK 细胞等的增殖和功能9 。Sheu 等的研究表明宫颈癌细胞通过产生 IL15 和TGF 上调 CD8+ CTLs 上抑制性受体 CD94/NKG2A 的表达, 从而抑制细胞的抗肿瘤效应10 。而我们在实验中通过 FCM 检测PBMC 表面 LAIR1 的表达情况发现: 与
11、单独 PHA 刺激组相比, IL15 或 TGF 加 PHA 刺激 72 h 后阳性细胞百分率与免疫荧光强度均有所下降,说明 IL15 和 TGF 都可以下调 PBMC 上LAIR1 的表达。IL15 和 TGF 都是具有重要免疫调节作用的细胞因子, 我们通过研究两种细胞因子对 PBMC 上抑制性受体 LAIR1 表达的刺激作用, 为深入探讨 LAIR1 表达的影响因素和功能提供了有价值的实验资料。【参考文献】1 Burns GF, Triglia T, Bartlett PF, et al. Human natural killer cells, activated lymphocyte k
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