HCV 结构的介绍

《HCV 结构的介绍》由会员分享，可在线阅读，更多相关《HCV 结构的介绍（9页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。

1、Questions 1对 HCV 的初步理解1、其基因结构：HCV 是正链 RNA 病毒，传播的途径为血液传播。基因全长为9.6kb 包括 5-NCR、一个长的开放阅读框（0RF ） ，编码组成约 3000 个氨基酸的多蛋白前体，和 3-NCR.2、目前 hcv 研究的现状：患者多，治疗方法不彻底，再感染几率大，潜伏期长，大部分患者会造成慢性肝炎，肝硬化，肝癌等疾病。研究其感染机制，病毒与宿主细胞的相互作用，一方面能够为制出特异性药物提供思路，另一方面是研发有效疫苗的必经之路。目前病毒性肝炎的治疗多以聚二乙醇干扰素和利巴韦林，蛋白酶抑制剂联合用药，但是机体对干扰素应答的副作用大，再感染几率高。

2、在研究方面 HCV 感染后血清中病毒含量极低，同时目前缺乏有效的体外培养系统及合适的动物模型繁殖病毒，无法获得大量的天然病毒抗原，目前只能通过合成肽或基因重组的方法，获得 HCV 包膜蛋白抗原。同时还缺乏有效的疫苗。3、感染后缺乏有效的免疫的可能原因（1 ）HCV 高度变异，逃避机体的免疫清除；（2）HCV 在肝组织及血液中含量低及诱导机体产生保护性的抗原性弱；（3 ）病毒颗粒与低密度脂蛋白或免疫球蛋白紧密联接，导致抗原决定簇被掩盖；（4）外周血淋巴细胞可能有 HCV储存库的作用。4、研究点：对于以上问题决定我们研究 HCV 的方向为编码蛋白和宿主因子在 HCV 复制、组装过程中相互作用，治病

3、机制、疫苗的开发等。Questions 2该病毒蛋白的结构和功能（功能机构，与宿主细胞相互作用，引发疾病）1、 HCV 的 RNA 及其翻译加工HCV 含有 9.6 kb 的正链 RNA 基因组 5-NCR，一个长的开放阅读框，编码组成约 3000 个氨基酸的多蛋白前体，和 3-NCR.5-NCR 高度保守，有 1-4 个域，域一不是 IERS 起始必须的，但是域一和二是 RNA 复制所必须的。每一个 HCV 都有一个 IERS 序列，是翻译起始必须的序列。3-NCR 由一个 80 个核苷酸序列组成的多聚 U 的可变区和一个由 98 个核苷酸组成的X-尾巴的不变区组成。3-NCR 是一个顺势作

4、用原件，编码 NS5B 蛋白。在细胞培养和体内时 3-NCR.和 5-NCR 都是必须的。5-NCR 的域二，三，四和核心基因的 20-40 个核苷酸构成 IRES 序列。RNA 的翻译起始：IERS 序列和 40S 核糖体结合形成一个 48S 的二元复合物，然后在真核生物起始因子 eLF3 的帮助下与 RNA 上的 AUG 序列结合，形成 eIF2Met-tRNAiGTP 三元复合物，最后的限速步骤是依赖于 GTP 的与 60S 核糖体结合成 80S 的复合物。HCV 的 ORF 翻译产生了蛋白前体是共翻译后通过细胞和病毒蛋白酶处理为成熟的结构与非结构蛋白。结构蛋白和 p7 多肽是由内质网处

5、理（ER ）信号肽酶处理而非结构蛋白由两种病毒 NS2-3 蛋白酶和 NS3-4A 丝氨酸蛋白酶处理。2、 核心蛋白 coreHCV 的 ORF 翻译的第一个蛋白，其由功能区转入内质网腔的信号在内质网膜上 C 与 E1 之间。信号序列被信号肽酶裂解。最终成为分子量为 21 道尔顿的核心蛋白 .其 N 端是高比例的碱性氨基酸，称为 D1，可以使两个同源 RNA 聚合在一起。核心蛋白发现与内质网膜上的脂滴中，为高度螺旋蛋白。脂滴是一个相对疏水的环境，这不仅确保蛋白质的折叠还有利于病毒蛋白的复制，形态发生。核心蛋白与脂滴可能相互作用影响脂质代谢，促进肝脏的脂肪变性，这是经常出现在 C 型肝炎，特别是

6、患者感染基因型 3。3、 包膜糖蛋白 E1 和 E2。包膜蛋白 E1 和 E2 是糖基化形成的非共价复合物，给病毒形成一个保护囊。丙型肝炎病毒糖蛋白的成熟和折叠是一个复杂的过程，涉及 ER 机械伴侣和取决于二硫键形成以及糖基化。跨膜结构域 E1 和 E2，位于其 C 末端的异源二聚体并具有 ER 滞留性能。都由两个可延伸的疏水性氨基酸通过短极性键连接。第二疏水片段为 E2 下游和 p7 中内部信号肽蛋白质。内信号序列断裂前，E1 和 E2 的跨膜结构以发夹结构与易位子相连。信号肽裂解之后，信号序列被重新定位，偏向胞质溶胶，最终形成单一的跨膜通道。E1 和 E2 的三维结构的测定将是为阐明由这些

7、蛋白质介导受体结合和融合过程的关键。4、 P7。P7 是一个 63 个氨基酸的多肽与 E2 常不完全切割。它的两个跨膜通过一个的胞质环连接，并且 N 端和 C 端被定向向 ER 内腔。在体外， HCVRNA 复制中 p7 不需要，但在体内生产性感染中必不可少。据报道，根据其低聚物和阳离子通道活性，这表明它属于的体内蛋白质家族，并在病毒颗粒的成熟和释放中有重要的作用。因此可用于对抗病毒药物干预。5、 NS2-3 蛋白酶。NS2-3 蛋白酶也被称为该 autoprotease，是丙型肝炎病毒难以研究的蛋白质之一。对于HCV 在体 RNA 复制是可有可无的，但无论在体外还是体内其对复制的周期所必需的

8、。NS2-3 蛋白酶催化活性在 NS2 的 C-末端半和 NS3N 端三分之一处。定点诱变表明，氨基酸His143， Glu163 和 Cys184 是蛋白水解活性所必须的。NS2 是与细胞膜有关的蛋白。其 N-末端域包含至少一个（可能是三个）跨膜段，缺乏该域重组蛋白名保留该酶的活性。NS2的蛋白酶晶体结构域的结构（氨基酸残基 94-217，NS2pro）得以解剖。NS2pro 形成的二聚体具有两个复合活性中心。每个活性中心都是由两种残基单体组成，一种单体是残基His143 和 Glu163，另一种单体是 Cys184 残基。这种结构改变了 HCV 的蛋白加工的看法，如以前认为 NS2-3 裂

9、解发生在顺单分子反应（因此指定 autoprotease） 。但是，对于二聚化以形成活性 NS 2-3 蛋白酶要求表明 NS2-3 裂解和络合物形成可以由 NS2 的浓度来调节。 了解 N 末端膜结构可能会 NS2 额外的功能如最近发现的生产感染病毒必需影响病毒生命周期的一步。有趣的是，高效的 HCV 嵌合体的融合位点在 NS2 构建。6、 NS3-4A 复合物。NS3 是一种多功能蛋白，位于 N-末端的三分之一处是一种丝氨酸蛋白酶位于 C 末端三分之二的蛋白质具有 RNA 解旋酶/ NTPase 活性。这两种酶的活性已经充分表征，以及高分辨率结构具有已经得到。该 NS4A 多肽的 NS3 丝

10、氨酸蛋白酶用作辅因子。其中心部分被合并为一个整体组分掺入酶核心，和其 N-末端部分与膜形成 NS3-4A 复合物。该 NS3-4A 丝氨酸蛋白酶已经成为制定特定抑制剂作为抗病毒药物的对象。其催化中心为His57，Asp81 形 Ser139。底物特异性的决定因素包括：酸性氨基酸残基在 P6 处的位置，到P1 半胱氨酸（包括反式切割位点）或苏氨酸（ciscleavageNS3 和 NS4A）和氨基酸之间用小侧链连接的残余物，即，丙氨酸或丝氨酸，在 P1位置（一致切割序列 D / EXXXXC / TS / AXXX） 。NS34A 丝氨酸蛋白酶有一个不同寻常的浅底物结合的口袋里，因此需要长期的与

11、表面底物互动。最近已经表明在先天性免疫中，NS3-4A 丝氨酸蛋白酶切割两个无活性的重要接头蛋白，即 Trif77（也称为 TICAM-1）和 Cardif（也称为 MAVS79，IPS-1 和 VISA） 。Cardif 蛋白是线粒体外膜上蛋白，以前观察到一个 NS3-4A 的小部分定位于线粒体上。这些发现对于 HCV 发病原理的研究将产生极大的影响。NS3 解旋酶是 2DExH/ D 盒解旋酶家族的成员。它结合双链 RNA 使其解螺旋，或结合单链RNA 具有广泛的二级结构的区域，利用对 ATP 水解螺旋。7、 NS4-B。NS4B 是相对分子质量为 27-kDa 的蛋白质。其功能之一是诱导

12、形成膜状结构，所述特异性膜改变在 HCV 复制复合物中作为支架。它被预测含有 4 个跨膜片段和最近一直报道两个 C 端半胱氨酸被棕榈酰化残基且以形成低聚物。但是，详细膜拓扑和低聚中的作 NS4B 功能仍有待澄清。8、 NS5-A。NS5-A 是磷酸化蛋白质，发现有底部磷酸化 56KDa 的和过磷酸化 58KDa 的蛋白质。最近的生化和功能研究表明，-同种型蛋白激酶 CKI 的可负责 NS5A 的过磷酸化。NS5A 的磷酸化是丙型肝炎病毒属和瘟病毒中的保守特征，并且还发现，在黄病毒 NS5 蛋白，认为它在 HCV 生命周期中发挥重要作用。细胞培养适应性突变往往会影响位于中心的丝氨酸所需要的超磷酸

13、残基，这表明这 NS5A 磷酸化状态调制 HCV RNA 复制的效率。根据一种模式，NS5A 的过度磷酸化减少与人小泡相关膜蛋白相关蛋白 A（HVAP-A）的相互作用。此囊泡分拣蛋白包括在脂滴中非结构蛋白和参与病毒 RNA 复制的相关蛋白。NS5A 是通过 N 端的两亲性 螺旋嵌入膜双层的胞质小叶锚定于膜一个蛋白。这个螺旋具有被嵌入在胞质膜界面的疏水性，富色氨酸面，而极性，带电面暴露于胞质溶胶和可能是参与特定蛋白质 - 蛋白质相互作用，这对功能性的 HCV 的形成复制至关重要对重组 NS5A 进行序列分析和同时比较三个蛋白质水解域（翻译可能错误）该晶体的保守结构域一的结构膜 - 锚定 螺旋透出

14、二聚结构和限定的表面特性可能涉及与病毒 RNA 和细胞膜蛋白的相互作用事实上， 假设背向从该膜产生爪状“二聚体槽，可以容纳任单链或双链 RNA。深，高碱性凹槽部分可以用有利于接触 RNA，延伸出来的部分酸性强，有助于防止 RNA 的退出槽。NS5A 的 RNA 结合性质已被生物化学证实。根据一种假说，多个 NS5A 二聚体可以形成对细胞内的膜的二维阵列，从而产生一个“基本铁路将允许 RNA 的滑动。 NS5A 的其他区域将保护其免受细胞 RNA 酶降解，或从识别由双链 RNA 诱导的抗病毒防御机制。根据这个模型，NS5A 将系绳病毒 RNA 到细胞内膜和协调其不同。根据一种假说，多个 NS5A

15、 二聚体可以在细胞膜形成二维阵列，从而产生一个“基本通道允许 RNA 的滑动。 NS5A 的其他区域将保护其免受细胞 RNA 酶降解，或识别由双链 RNA 诱导的抗病毒防御机制。根据这个模型，NS5A 将病毒 RNA 束缚在细胞内膜并协调不同丙型肝炎病毒复制过程中的命运。 在受感染的细胞中，许多核心蛋白分子需要以基因组 RNA 复制产生掺入大量过量非结构蛋白。这些非结构蛋白在膜上的形成的格或列可能有其他的功能。在 HCV 复制中只有一小部分的非结构蛋白参与 RNA 的复制。如上所述，过量的非结构蛋白的积累也可能是用于启动 RNA 复制之前拮抗宿主细胞的重要先天抗病毒途径。9、 NS5B。HCV

16、 是正链 RNA 病毒。无论是利用病毒 RNA 作为模板，利用宿主细胞的复制系统复制出负链 RNA 或者随后形成的正链 RNA 的复制都依赖 NS5B RDNP 酶。该酶被广泛的描述，NS5B也成为研制抗病毒药物的对象。HCV NS5B 蛋白中含有所有 RdRps 基序，包括标志 GDD 内基序、C 序列，并基于所述相似性酶结构的右手的形状的，经典的手指，手掌和拇指子域。丙型肝炎病毒的 RdRp 的一个特点是，广泛手指和拇指子域之间的相互作用导致一个完全封闭活性位点。此功能和其他 RdRps 酶相同。类似的脊髓灰质炎病毒的 RdRp，已报道 HCV NS5B 的低聚为 RNA 合成的活性重要条件。丙肝病毒 RdRp 是所谓的“尾锚定蛋白” 。膜联系是由 C 末端 21 个氨基酸残基，在体外这是可有可无的聚合酶，但在细胞内是 RNA 复制不可缺少的。膜定位发生由翻译后机制并造成 NS5B 的完整的膜关联。10、 ARFP /F 蛋白另一种阅读框（ARF）在 HCV 核心编码区被确定的是，作为在基因型 1a -