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1、1Caspase3 与脑缺血再灌注损伤【关键词】 Caspase3;细胞凋亡; 脑缺血再灌注损伤近年来随着生物技术进展，更多证据表明脑缺血再灌注后神经元死亡由凋亡和坏死共同引起1 ，近年来减少脑缺血再灌注后神经元的凋亡一直是脑缺血再灌注保护中的热门课题。Caspase 是一个半胱氨酸蛋白酶家族，在细胞凋亡的过程中起着关键性的作用。Caspase 最先是在对线虫的研究中发现的，CED3 是线虫的自杀基因，其编码产物 CED3 能引起线虫细胞凋亡2 。Caspase3在脑缺血后程序性细胞死亡过程中的激活将导致 DNA 修复蛋白、细胞骨架蛋白及其他 Caspase 相关底物蛋白的裂解，最终导致细胞凋
2、亡的发生，直接参与了脑缺血再灌注损伤的病理生理过程。目前有关这方面的研究尚处于揭示阶段，现综述如下。1 Caspase3 与细胞凋亡1.1 Caspase 的分类 Caspase 半胱氨酸蛋白酶家族在氨基酸序列、结构及酶的特性上均相似，通常情况下以无活性的酶原形式存在于细胞中，酶原分子由 3 部分组成，一个 N 端前域及一大一小两个亚基，酶原分子激活后，大小亚基解离并重新组装为四聚体形式的活性酶3 。由于 Caspase 可自我活化并能相互激活，因此凋2亡过程一旦触发，即呈级联放大效应。根据 Caspase 在级联反应上下游的位置及功能的不同，可分为 3 大类，第 1 类为凋亡始动子，位于级联
3、反应上游，包括Caspase2、Caspase8 、Caspase9 、Caspase10 等，能在其他蛋白参与下发生自我活化并激活下游的 Caspase。第 2 类为凋亡效应子，位于级联反应下游，包括Caspase3、Caspase6 、Caspase7 ，能被上游的始动子激活，激活后的 Caspase 作用于特异性底物使细胞发生生化及形态学改变，导致细胞凋亡。第 3 类包括Caspase1、Caspase4 、Caspase5 、Caspase13 、Caspase14，主要参与细胞因子介导炎症反应并在死亡受体介导的细胞凋亡途径中起辅助作用。1.2 Caspase3 的特性及在细胞凋亡中的
4、作用 Caspase3又称为半胱氨酸蛋白酶 32(cysteine protease p32，CPP32) ，或称Yama 及凋亡素等，是 1994 年被发现的一个促凋亡调节基因，相对分子质量为 32 kU，在人类基因中定位于 4q324q35 处4 。其激活过程是：Caspase3 前体物质 procaspase3 水解产生一个由 p20 和 p10 亚基组成的二聚体，形成活性形式的caspase3。procaspase3 本身并没有催化活性，在活化时首先由颗粒酶 B(GrzB)或 caspase10 在 D175 剪切下小片段后它才被部分活化，随后则可进行下一步的自我催化4 。在剪切原结构
5、域3时可能还有其他 caspase 如 caspase1 的参与 4 。caspase3最主要的底物是多聚(ADP 核糖)聚合酶 PARPpoly(ADPribose)polymerase ，该酶与 DNA 修复、基因完整性监护有关。在细胞凋亡启动时，caspase3 在其上游物质 caspase10、caspase8等激活下作用于 PARP，116 kD 的 PARP 在 Asp216Gly217 之间被 caspase3 剪切成 31 kD 和 85 kD 两个片段，使 PARP 中与DNA 结合的两个锌指结构与羧基端的催化区域分离，不能发挥正常功能，结果使受 PARP 负调控影响的 Ca
6、2+/Mg2+依赖性核酸内切酶的活性增高，裂解核小体间的 DNA，从而引起细胞凋亡4 。这种裂解过程可被 caspase3 的特异性抑制剂 AcDEVDCHO 所抑制，但不能被牛痘病毒蛋白 CrmA 抑制4 。Caspase3 还可以剪切 U170K、DNAPK 、PKCd 和 PKCq 。PKCd 和 PKCq 都属于新型 PKC(novel protein kinase C，nPKC)，当被 caspase3 剪切后，可以切除调节区域，而成为活性形式的 PKC，而 PKCd 和PKCq?的过量表达均可以参与细胞凋亡的诱导，促进细胞凋亡发生4 。2 脑缺血再灌注与神经细胞凋亡研究发现5 ，脑
7、缺血再灌注可诱发细胞凋亡，脑缺血再灌注后脑组织中凋亡的细胞大多为神经细胞，少数为胶质细胞和血管内皮细胞。有实验表明大鼠全脑缺血再灌注后海马区延迟性神经元4死亡是不同于坏死的一个过程6 ，凋亡是其神经元丢失的重要原因。全脑缺血再灌注后，海马各区两种功能相反的凋亡相关基因bcl2 和 bax 的区域性表达很可能参与了延迟性神经元死亡的发生7 。有报道，大鼠脑组织缺血 10 min 不引起神经元凋亡，永久性脑缺血 60 min，其病理变化为坏死，缺血再灌注后则可造成神经元凋亡，细胞凋亡的数目随时间变化呈曲线波动8 。表明在脑缺血过程中，决定细胞凋亡或坏死的主要因素为缺血的严重程度及细胞的选择易患性，
8、缺血后细胞丢失方式可能决定于损伤程度。严重缺血引起能量衰竭导致细胞内钠、钙升高，使细胞溶解、坏死;轻微缺血及再灌注损伤易触发细胞凋亡。研究表明：缺血 2 h 再灌注 0.5 h，视前区的缺血区有较多的凋亡细胞，随着再灌注时间的延长，凋亡细胞散在分布于视前区、纹状体、大脑皮质9; 再灌注 12 h 凋亡细胞数量达高峰;持续再灌注 24 h，此时可见凋亡细胞的各种形态，由此反映出神经元对缺血再灌注损伤的敏感性不一，也说明了细胞凋亡是一个动态的发展过程。3 Caspase3 与脑缺血再灌注损伤3.1 Caspase3 在脑缺血再灌注损伤中的作用 脑缺血后继发的病理生理改变对脑细胞造成的损伤是脑缺血损
9、伤的重要原因之一。一般认为：坏死与凋亡是受损脑细胞死亡的两大主要机制， 当损伤达到一定程度时引起细胞坏死， 而低程度的损伤则导致细胞凋5亡10 。近年来研究发现， caspase3 蛋白参与了脑缺血后神经元损伤的病理过程， 在脑缺血中再灌注损伤起重要的作用11 。Caspase3 作为 caspase 家族中的一员，是凋亡的关键酶，在细胞凋亡过程中处于核心位置，因此 caspase3 被称为死亡蛋白12 。最近研究发现，脑缺血再灌注损伤使 procaspase3 表达增加，并可能诱发 procaspase3 去磷酸化，继而促进procaspase3 转化为活性形式 caspase3，从而引起细
10、胞凋亡13 。另外，通过脑室内注射广谱的 Caspase 及 Caspase3 抑制剂获得对缺血性脑损伤的保护作用也支持脑细胞缺血死亡涉及Caspase3 活性的观点14 。Pike 等15在实验中观察到在脑缺血后存在细胞周期蛋白 (calpain)和 Caspase3 的激活，而且同时伴有坏死和凋亡的形态学表现，说明两者共同参与了脑缺血再灌注后继发性损害的过程。以上资料说明对 Caspase3 进行调控，抑制其表达可能是抑制脑缺血再灌注损伤、发挥脑保护治疗的另一途径。王宇卉等16 研究了 Caspase3 抑制剂 AcDEVDCMK 及 calpain 抑制剂ALLN 干预治疗对大鼠局灶性脑
11、缺血/ 再灌注模型的神经保护作用，结果是 AcDEVDCMK 或 ALLN 治疗后缺血侧脑中及 TUNEL 阳性细胞数均明显减少，进一步证明了 Caspase3 在脑缺血再灌注后引发神经元凋亡中的重要作用。63.2 Caspase3 在脑缺血再灌注损伤中的作用机制 天冬氨酸特异的半胱氨酸蛋白激酶家族(Caspases)是细胞凋亡过程中最重要的蛋白酶， 凋亡的最后实施是通过 Caspases 的激活而实现的。Caspases 的激活表现为 “瀑布式”的级联反应， 而 Caspase3 是 Caspases 级联反应中下行的最关键的凋亡执行蛋白酶， 在各种程序启动的凋亡程序中起最后枢纽的作用17
12、，它的激活可通过裂解 DNA 依赖性蛋白激酶等， 改变其结构，促使细胞凋亡18 。有研究发现19，20 ， 在缺血性神经损伤过程中， 抑制Caspase3 活性可产生明显的神经保护作用。在上述引发脑缺血再灌注损伤的各种因素作用下凋亡的立早基因(如 cjun，cfos 等)表达增强，由 cjun 氨基末端激酶3(cjunNH2 terminal kinase3，JNK3)激活死亡受体配体 (FASL)及抑制 bcl2(B cell lymphoma/leukemia)，通过死亡受体介导的凋亡途径和线粒体依赖的途径分别激活 Caspase3，而 Caspase3在脑缺血再灌注后程序性细胞死亡过程中
13、的激活将导致 DNA 修复蛋白、细胞骨架蛋白及其他 Caspase 相关底物蛋白的裂解，最终导致神经细胞凋亡的发生。关于 Caspase3 在脑缺血再灌注后细胞凋亡中的作用机制问题，多数的观点为，Caspase3 激活后可裂解细胞内固有的和保护性的酶类，进而形成细胞凋亡的形态学及生物化学特征性改变，对脑缺血再灌注后细胞凋亡起重要作用。4 结 语7Caspase3 的激活在脑缺血再灌注损伤的发病过程具有重要地位，是脑缺血再灌注后神经细胞凋亡发生的最后通路，因此Caspase3 也成为很多治疗脑缺血再灌注损伤药物的靶点。然而，Caspase3 在脑缺血再灌注损伤发生发展中所涉及到的许多信号转导通路
14、、相关的信号分子及其机制尚未完全阐明，有待于进一步的研究。【参考文献】1 Matsushita K，Matsuyama T，Kitagawa K,et al.Alterations of Bcl2 family proteins precede cytoskeletal proteolysis in the penumbra，but not in infarct centre following focal cerebral ischemia in miceJ.Neuroscience，1998;83(2);43948.2 Henning RS，Guy SS.Caspase：preparati
15、on and characterizationJ. Methods，1999;17(4):3139.3 Nicholson DW.Caspase structure，proteolytic substrates， and function during apoptotic cell deathJ.Cell Death Differ,1999;6(11):102831.84 Varghese J，Chattopadhaya S，Sarin A.Inhibition of p38 kinase reveals a TNF22 mediated，caspase dependent，apoptotic
16、 death pathway in a human myelomonocyte cell line J.J Immunol,2001;166 (11)：65707.5 Peng J，Mao XO，Stevenson FF,et al.The herbicideparaquat induces dopaminergic nigral apoptosis through sustained activation of the JNK pathwayJ .J Biol Chem,2004;279(31):3262532.6 Kutuk O，Poli G，Basaga H.Resveratrol protects agains
