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1、1Calphostin C 逆转人肾癌内源性阿霉素耐药作用的机制【摘要】 目的 探讨蛋白激酶 C alpha 抑制剂对肾癌细胞多药耐药（MDR ）逆转作用的机制。方法 应用荧光显色法、 RTPCR检测 PKC 基因的表达情况及 PKC cDNA 转染肾癌 7860 细胞前后细胞中 MDR1 表达的变化；采用14CADM 标记法检测PKC 激动剂 Calphostin C、抑制剂 PMA 作用 PKC/7860 细胞系内阿霉素（ADM）浓度变化；测定 PKC 激动剂以及与 PKC 抑制剂对肾癌细胞细胞生长抑制率；分别测定 ADM 与 PKC 激动剂以及与 PKC 抑制剂协同作用后,7860 细胞
2、和肾癌转染细胞系PKC/7860 耐药性的变化。结果 肾癌转染细胞系 PKC/7860的 MDR1 表达水平高于肾癌 7860 细胞。Calphostin C、PMA 作用后 MDR1 基因表达分别出现升高和降低。 Calphostin C 协同ADM 对肾癌细胞具有较强的抑制作用，且抑制作用呈浓度依赖关系。ADM 与 PKC 抑制剂协同作用的 PKC/7860 细胞系耐药性明显降低。结论 PKCcDNA 的转染可以提高 7860 细胞的耐药性，而 PKC 的选择性激动剂和选择性抑制剂则分别可以增加和逆转肾癌细胞对 ADM 的耐药性，其途径可能是通过促使肾癌细胞内源性ADM 耐药发生变化进而影
3、响细胞内化疗药物的浓度来实现的。 【关键词】 蛋白激酶 C；多药耐药；肾癌2在众多肿瘤组织中，肾癌细胞存在许多独特的特征，包括出现多药耐药（MDR ） 、对放疗效果不佳等。肾癌细胞内源性耐药表型的出现，使其对多种化疗药物失效。蛋白激酶 C（PKC)作为一类钙磷脂依赖性磷酸化酶，广泛存在于机体内并分布在几乎所有的组织和器官中。不典型 PKC(aPKC)包括 PKC， 和 三种亚型1 。本研究前期工作已经证明肾癌组织中 PKC 含量异常增高2 。近期研究提示 PKC 伴随 MDR 表型而呈现高表达现象3 ，提示PKC 抑制剂可能有助于提高抗癌药物发挥抑制肿瘤细胞生长的作用。1 材料与方法1.1 材
4、料7860 人肾癌细胞，购自上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所。PKC 要 cDNA 全长开放阅读框架 (ORF)、羧基端融合绿色荧光蛋白(Cterminal fusion to green fluorescent protein)的表达载体 pcDNADEST47、Script Firststrand Synthesis For RTPCR 试剂盒、脂质体 Lipofectamine2000plus、Trizol 试剂、GatewayBP 和 LR ClonaseTM enzyme mix 购自 Invitrogen 公司；G418 购自 3Gibercol BRL 公司；PKC
5、抑制剂 Calphostin C、PKC 激动剂佛波醇酯 （PMA ）和 Adriamycin 购自 Sigma 公司；14CAdriamycin 购自 GE Healthcare Life Sciences 公司。Pyrobest DNA 聚合酶购自 Takara 公司。1.2 方法1.2.1 细胞培养细胞置于 37培养，RPMI1640 培养基中，加入 10胎牛血清（FBS） ，2 mmol/L 谷氨酰胺及 25 mmol/L HEPEs,置入湿润的 5CO2 培养箱中培养细胞。每 23 d 传代 1 次，取对数生长期的细胞进行实验。1.2.2 质粒构建 人 PKC cDNA 采用 Gat
6、ewayTM 技术、BP 反应技术和 LR 反应重组技术及 Pyrobest DNA 聚合酶，创建羧基端融合绿色荧光蛋白表达 PKC 的 pcDNADEST47PKCGFP 表达载体。扩增引物：5ATGGCTGACGTTTTCCCGGGCAA3；5CATACTGCACTCTGTAAGATGGGG3。扩增片段度为 2 245 bp。1.2.3 基因转染及鉴定4取对数生长期 7860 细胞，以 4105/每孔接种 12 孔板，待完全贴壁后开始转染。以 pcDNADEST47PKCGFP 表达载体作为目的基因，按以下方法进行脂质体转染：0.6 g DNA，2 l plus,2 l Lipofecta
7、mine2000plus,加入无血清 RPMI1640 培养液至反应终体积为 500 l，吸取孔内培养液，加入转染液 37 孵育35 h，换含 10%胎牛血清的 RPMI1640 培养液，37孵育 24 h， Fluoview 共焦激光扫描显微镜下，激发波长为 480 nm，吸收波长为 510 nm。以 FITC 过滤观察绿色荧光蛋白的即时表达，观察转染效率同时观察荧光在细胞内亚细胞区域的分布变化。转染 48 h后，加入 G418 进行筛选,浓度为 400 ng/ml。培养 2 w,部分细胞仍能表达 GFP,但表达程度不一。约 4 w 后，产生阳性克隆，传代扩增，命名为 PKC/7860 细胞
8、。然后用 Trizol 提取 PKC/7860 细胞株总 RNA（以 7860 细胞作为对照） ，按 Invitrogen 公司 Super Script Firststrand Synthesis For RTPCR 步骤进行 PKC 逆转录，引物同上（以 actin 作为内参照，引物见表 1） 。1.2.4 PKC 激动剂、抑制剂作用前后 MDR1 基因表达变化以 100 nmol/L PMA 或 100 nmol/L Calphostin C 作用PKC/7860 细胞，RTPCR 检测 PKC 激动剂、抑制剂作用前后细胞内 MDR1 表达（引物见表 1） 。表 1 各 PCR 引物及产
9、物长度（略）51.2.5 细胞内霉素（ADM ）浓度的测定取对数生长期的 PKC/7860 细胞,分别计数 1 105 个细胞接种于 24 孔板中,加入 RPMI 1640 培养 24 h,待细胞贴壁后，以100 nmol/L PMA 或 100 nmol/L Calphostin C 预作用PKC/7860 细胞，弃去培养液，更换终浓度为 0.5 mol/L 的14CADM 无血清培养液,5%CO2,37温育 1.5 h，使其到达稳定期, 离心弃去含药培养液, 用冷 PBS 将细胞洗 3 次。将细胞在含0.5 %SDS 的 PBS 0.2 ml 中重悬,裂解, 液体闪烁计数仪测定其放射性，重
10、复 3 次。1.2.6 PKC 激动剂、抑制剂对肾癌细胞生长抑制影响以 MTT 法，将 PKC/7860 细胞接种 96 孔细胞培养板，37孵育 12 h 后，先以 100 nmol/L PMA 或 0，50,100,150,200 nmol/L Calphostin C 预作用 2 h，PBS 轻洗 3 次后，更换含 0.5 mol/L 的 ADM 培养液，每孔 100 l，每个浓度设 6 复孔，对照只加培养液；37孵育 36 h 后，加入 MTT，37孵育 4 h，更换DMSO，37孵育 4 h 后，酶标仪 540 nm 读取光密度值(OD)。以不加 PMA 或 Calphostin C
11、预处理的 PKC/7860 为对照计算细胞生长抑制率。61.2.7 PKC 激动剂、抑制剂对肾癌细胞耐药性影响以 MTT 法，将两种细胞分别接种 96 孔细胞培养板，37孵育 12 h 后，分为 2 组。取一组细胞先以 10 nmol/L PMA 或 10 nmol/L Calphostin C 预作用 2 h，PBS 轻洗 3 次后，更换含 ADM的培养液；另一组直接更换 ADM 液。ADM 梯度浓度为0.1、10、30、100 、 300、nmol/L，1 、3、10、30、100 、300 mol/L，每孔 100 l，每个浓度设 3 复孔，对照只加培养液；37孵育 36 h 后，加入
12、MTT，37孵育 4 h，更换 DMSO，37孵育 4 h 后，酶标仪 540 nm 读取光密度值 (OD)，采用 PRISM 软件计算 IC50。1.3 统计学分析采用 PRISM 软件及 Students t 检验。2 结果2.1 pcDNADEST47PKCGFP 表达载体对 7860 细胞的转染和鉴定见图 1。转染载体 24 h 后，荧光倒置显微镜观察绿色荧光蛋7白的即时表达。第 4 周时出现大量转染细胞，传代扩增并命名为PKC/7860。2.2 PKC 基因 RTPCR 结果见图 2。总 RNA 经变性琼脂糖凝胶电泳见 28S、18S rRNA条带清晰,紫外分光光度计测定260/28
13、0 均大于 1.9。在 RNA 相同量的条件下,actin 的扩增条带基本相同；而 7860 与PKC/7860 细胞扩增 PKC 片段(2 245 bp)条带出现明显差异，PKC/7860 细胞扩增条带十分明显，7860 细胞则未出现条带。2.3 PKC 激动剂、抑制剂作用后 MDR1 基因变化见图 3。在 actin 扩增条带基本相同的情况下， PMA 处理的 PKC/7860 细胞 MDR1 含量最高，与无干扰因素下的PKC/7860 细胞相比，Calphostin C 处理的 PKC/7860 细胞MDR1 含量明显下降。2.4 细胞内 ADM 浓度的测定PMA、Calphostin
14、C 预处理后，PKC/7860 细胞中14CADM 浓度分别为 130 nmol/L、716 nmol/L，未预处理8的 PKC/7860 细胞中14CADM 浓度为 315 nmol/L,Calphotin C 作用后，PKC/7860 细胞中的浓度为 PMA作用后的 5.8 倍，此结果与 MDR1 基因变化相一致。2.5 PKC 激动剂、抑制剂对肾癌细胞生长抑制影响见图 4。Calphostin C 协同 ADM 对肾癌细胞具有较强的抑制作用，且这种抑制作用随 Calphostin C 浓度增加而增大，呈浓度依赖关系。对肾癌 PKC/7860 细胞的抑制率最低为 13.9，最高为 59.6
15、。相比之下，PMA 处理后的细胞存活率比未加干扰因素的 PKC/7860 多 32.7。2.6 PKC 激动剂、抑制剂对肾癌细胞耐药性影响转染后 PKC/7860 对 ADM 的 IC501.658 8e-6(1.162 1e-62.367 7e-6)是 78607.801 5e-7(5.704 6e-7 1.066 9e-6) 的 2.13 倍（P0.01） ；而给予 PKC 特异性激活剂PMA 的 PKC/7860 的 IC502.679 4e-6(2.0521e-6 3.498 3e-6)增加了 1.62 倍（ P0.05） ；当给予 PKC 抑制剂Calphostin C 时，PKC/7860 对 ADM 的 IC509.2506e-8(5.933 7e-81.442 2e-7)则下降 17.93 倍（P0.01 ） ，与7860 相比下降了 8.43 倍（P0.01 ） 。 说明 PKC cDNA 的转9染可以提高 7860 细胞的耐药性，而 PKC 的选择性激动剂和选择性抑制剂则分别可以增加和逆转肾癌细胞对 ADM 的耐药性。3 讨 论正常细胞生理状态下，PKC 参与调控细胞周期，并对细胞生长与凋亡有调节作用。为保持细胞间功能的协调，机体常通过内源性机制使其活性下调，PKC 被激活
