《CA 125阴性卵巢上皮性恶性肿瘤患者血清相关蛋白检测及其意义》由会员分享，可在线阅读，更多相关《CA 125阴性卵巢上皮性恶性肿瘤患者血清相关蛋白检测及其意义（11页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1CA 125 阴性卵巢上皮性恶性肿瘤患者血清相关蛋白检测及其意义【摘要】 目的 研究 CA 125 阴性卵巢上皮性恶性肿瘤患者血清相关蛋白检测及其意义。方法 取 CA 125 阴性卵巢上皮性恶性肿瘤和卵巢良性肿瘤、盆腔良性病变和正常妇女血清，采用双向电泳技术分离和鉴定生理状态与病理状态的差异表达蛋白，对有差异性表达的蛋白质运用 MALDITOFTOF 串联质谱分析。结果 重复性好的双向电泳图谱在 CA 125 阴性卵巢上皮性恶性肿瘤患者血清蛋白质表达谱发生了改变。将其中有差异蛋白点经指纹图谱(PMF)分析，并结合双向电泳相应点的表观等电点、分子质量、匹配片段的多少以及相关文献进行综合分析。得
2、到 CA 125 阴性时的蛋白质有 8 种，分别为结合珠蛋白 1、prostasin、calgranulin A 和 calgranulin B、溶血磷脂酸(LPA) 、增殖细胞核抗原(PCNA) 、HSP 60 和 90。结论 双向电泳 质谱法对卵巢上皮性恶性肿瘤患者血清蛋白获得的结果重复性较好。CA 125 阴性卵巢癌患者血清结合珠蛋白1、prostasin、calgranulin A 和 calgranulin B、LPA 、PCNA、HSP 60 和 90 能为其提供早期诊断指标。 【关键词】 双向电泳图谱； CA 125； 卵巢上皮性恶性肿瘤； 血清蛋白2【Abstract】 Obj
3、ective To investigate the significance of exploring the associated protein in serum of the patients with ovarian epithelial malignant tumornegative CA 125. Methods The serum from the epithelial malignant tumor of ovarynegative CA 125,benign tumor,benign lesion and healthy women were obtained.The dif
4、ferential expression protein in physiological functions and pathologic state were seperated and identified.The differential expression protein with MALDITOFTOF by means of mass spectrographic was analyzed. Results In the better picture of 2DE,the expression picture in the serum in epithelial tumor o
5、f ovary which is negative of CA 125 changed.By selecting spot of discrepancy protein and comprehensively analyzing the finger printing of the differential expression protein,and combining outside PI,molecular quality, the amount of matching fragment and the associated documents,we got 8 kinds of pro
6、tein in negative of CA 125,which were Hp1，prostasin ，calgranulin A and calgranulin B，LPA，PCNA，HSP 60 and HSP 90. Conclusion By using 2DEMS on the patients with ovarian epithelial tumor,we can get a good result of the protein in serum. Combining the serum of the patients with the epithelial malignant
7、 tumor of ovarynegative CA 125 with 3Hp1，prostasin，calgranulin A and calgranulin B，LPA ，PCNA，HSP 60 and HSP 90, we can provide the early diagnosis index for the patients with ovarian epithelial tumor.【Key words】 2DEMS；CA 125；Ovarian epithelial tumor；Protein in serum卵巢上皮性恶性肿瘤早期一般没有临床症状，发现时往往为中晚期，其 5
8、年生存率仅 25%左右。能早期发现卵巢上皮性恶性肿瘤，其 5 年生存率90%。CA 125 是临床上常用的筛选方法, 但阳性率只有 50%60%，而作为单一的标志物，CA 125 阳性预测值还不到 10%，即使在超声技术的辅助下，其阳性预测值只能达到20%1 。因此，发现特异性的肿瘤标志物，特别在 CA 125 阴性时，是诊断早期卵巢上皮性恶性肿瘤迫切需要解决的问题。本研究取卵巢上皮性恶性肿瘤和卵巢良性肿瘤、盆腔良性病变患者及正常妇女血清(后三者简称正常组) 进行 CA 125 检测，并采用双向电泳质谱(two dimensional gel electrophoresismass spect
9、rometry，2DEMS) 技术来分离和鉴定生理状态与病理状态的差异表达蛋白，为进一步研究卵巢上皮性恶性肿瘤发病机制及有效的诊疗手段提供实验依据。41 资料与方法1.1 一般资料1.1.1 标本采集 选择受试者 200 例，年龄 4668 岁，其中 CA 125 阴性的卵巢上皮性恶性肿瘤患者 100 例，卵巢良性肿瘤患者50 例，盆腔良性病变患者(包括子宫内膜异位症、盆腔炎性包块)25例，正常妇女 25 例，共收集血清 200 份，置于-70 冰箱保存。1.1.2 主要仪器及试剂 仪器：高速冷冻离心机、分光光度仪、电泳仪、冷却水循环系统；试剂：二硫苏糖醇、丙烯酰胺、甲双丙烯酰胺、过硫酸铵、十
10、二烷基磺酸钠等。1.2 方法1.2.1 血清总蛋白质的提取与定量 血清经-70反复冻融 4 次，用特种试剂去除 IgG 等高丰度蛋白。采用 Agilent 5K 超滤管进行浓缩除盐，冻干回收样品，-70保存备用。用裂解液(9 M Urea，4% CHAPS，65 mM DTT，cocktail 酶抑制剂)进行复溶，并采用Bradford 法进行蛋白质定量。1.2.2 等电聚焦 将-20保存的 IPG 胶条，于室温下平衡 10 5min，以 70 g 上样量于每份样品中加入上样缓冲液，总体积 250 l，沿 IPG 聚焦盘中槽边缘自左向右线性加入，胶面向下轻放入泡胀槽中，加入矿物油覆盖。1.2.
11、3 SDSPAGE 垂直电泳 采用 10.0%的均匀 SDS 聚丙烯酰胺凝胶。20 mA 电泳 15 min，然后 40 mA 电泳至溴酚蓝离胶下沿0.5 cm。1.2.4 凝胶银染 电泳结束后，立即予以硝酸银染色，通过固定、敏化、银染、显色、终止等步骤，直至背景清晰。1.2.5 图像分析 每个样品常规进行 3 次二维电泳，通过光密度扫描仪对二维电泳凝胶扫描，Imagemaster 软件对凝胶进行强度校正、点检测、背景消减、均一化、匹配、建立平均凝胶分析等。蛋白质点的相对强度百分比用来进行组间比较，升高或降低 150%者被定为差异点。1.2.6 MALDITOFTOF 串联质谱分析 用手术刀片
12、切下胶上目标条带，将第 1 级质谱得到的肽片段质量指纹图谱、肽质量指纹图谱与第 2 级质谱得到的肽序列信息一起用来检索蛋白质数据库，找出匹配的蛋白质。61.2.7 数据库检索 将质谱鉴定所得的 PMF 数据于BIOWORKS(Thermo Finnigan，San Jose，CA)软件搜索相应的库。2 结果2.1 蛋白浓度及双向电泳图谱 正常组血清蛋白浓度：(25.153.24)g/L，双向电泳图谱上可观察到 702 个蛋白点，蛋白点主要位于分子质量(25 70)103 Da，等电点 PI(47)处；恶性肿瘤组血清蛋白浓度: (22.803.18)g/L，双向电泳图谱上可见到 678 个蛋白点
13、，蛋白点主要位于分子质量(2070)103 Da，等电点 PI(48 处)(图 1、图 2)。2.2 差异蛋白质点的鉴定 选择明显的 9 个差异蛋白点，获得了9 张 PMF。将查询到的结果再结合双向电泳相应点的表观等电点、分子质量、匹配片段的多少等，并结合相关文献进行综合分析。在数据库中匹配到符合结果要求的已知蛋白质有 8 种。相应的蛋白质点有结合珠蛋白 1、prostasin、calgranulin A 和 calgranulin B、LPA 、PCNA、HSP 60 和 90(图 3)。3 讨论恶性肿瘤是一种多基因参与的复杂疾病，由于蛋白质组学研究是7直接定位于蛋白质水平，因此，通过对肿瘤
14、蛋白质的整体、动态、定量的研究，不仅有助于进一步揭示恶性肿瘤的发病机制，亦可用于发现能进行早期临床诊断的肿瘤标记物和寻找新的治疗靶标2 。卵巢上皮性恶性肿瘤是女性常见的恶性肿瘤之一，临床发病比较隐匿，缺乏特异性早期发病指征。近年研究提示，卵巢上皮细胞的异常增殖可能是卵巢上皮性恶性肿瘤发生的最早期改变。蛋白质组学有助于揭示卵巢上皮性恶性肿瘤发生发展的机制,为寻找肿瘤治疗提供新的靶点。Hp 在血浆中与游离的血红蛋白结合，是一种急性时相反应蛋白。根据 Ye 等3 的研究，卵巢上皮细胞的异常增殖可能是外周血中蛋白质之间相互作用而引起的异常升高，可作为 CA 125 的互补物来提高灵敏度和特异度。根据
15、Mok 等4的研究，Prostasin 是一种分子质量为 40 Kd 的胰蛋白酶样的丝氨酸蛋白酶，可在前列腺高表达，在肾、肝中低表达，但在卵巢组织中无表达。卵巢上皮性恶性肿瘤细胞中分泌型蛋白质 Prostasin 的基因过度表达，进入血液，使血液中 Prostasin 水平升高，故 Prostasin 是一种 CA 125 阴性时的恶性肿瘤标志物。Ott 等5发现卵巢癌患者血清中也发现 Algranulin A 和 Calgranulin B 这两种蛋白质，而良性肿瘤患者血清中没有这两种蛋白质，其在卵巢癌的囊液中含量最高，释放进入血液后使之升高，并以期和期水平最高，故可作为卵巢癌的早期诊断指标
16、，但其特异性和灵敏度还有待进一步研究。8Wirth 等6认为 Algranulin A 和 Calgranulin B 与肿瘤的发生有关。Xiao 等7 用电喷雾电离质谱分析卵巢癌患者血清中的LPA，发现 LPA 和 Lysophosphatidyl Inositl(LPI)显著升高。Xu 等8的研究中，98%(47/48)的卵巢癌患者 (包括各种组织学类型)血浆 LPA 升高，其中期卵巢癌的敏感性为 90%(9/10), 期及复发患者的敏感性为 100%(38/38)。因此，作者提出 LPA 可以作为诊断妇科恶性肿瘤的生物学指标，特别是早期诊断卵巢癌，比CA 125 更灵敏。目前通常认为 PCNA 能反映细胞群体增殖活性，而细胞的增殖活性与肿瘤的生物学行为，特别是肿瘤的浸润、转移和预后密切相关，增殖活性越强，恶性程度越高。因此 PCNA 常作为测定组织细胞增殖水平的指标之一
