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1、精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询脓毒症大鼠 JAK/STAT 信号通路对肝肿瘤坏死因子作者：王强，王松柏，窦科峰，姚永明 【关键词】 脓毒症 【Abstract】 AIM: The purpose of the present study was to investigate the effects of janus kinase/signal transducer and activator of transcription (JAK/STAT) pathway on the expression of tumor necrosis factor(TNF) in hepa
2、tic tissues of rats with sepsis. METHODS: Using a sepsis model by cecal ligation puncture (CLP), 78 male Wistar rats were randomly divided into normal control group (n=6), CLP group (n=24), AG490 treatment group (n=24) and rapamycin (RPM) treatment group (n=24). At serial time points in each group,
3、animals were sacrificed, hepatic tissue samples were harvested to determine TNF mRNA and protein expression levels. RESULTS: Compared with those of normal controls, the TNF mRNA levels significantly elevated in the liver 2-48 h after CLP (P 0.05) and the protein levels significantly increased at 2-4
4、8 h, respectively (P 0.05). Both treatment with either AG490 or RPM could markedly reduce hepatic TNF mRNA and protein 精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询expressions at 2, 6, 24 and 48 h following CLP (P 0.05). CONCLUSION: These data suggested that CLP sepsis challenge can increase TNF mRNA and protein expre
5、ssions, which may be involved in JAK/STAT pathway. Inhibiting the activation of JAK/STAT pathway can reduce hepatic TNF mRNA and protein expressions, which may help to prevent the tissue injury after sepsis. 【Keywords】 tumor necrosis factor; sepsis; signal transduction; rats; janus kinase 【摘要】 目的： 研
6、究 Janus 激酶/信号转导和转录激活子（JAK/STAT）通路对盲肠结扎穿孔术（CLP）所至严重腹腔感染大鼠肝组织肿瘤坏死因子 （TNF）表达的调节作用. 方法： 采用CLP 模型，78 只大鼠随机分为正常对照组(6 只)、CLP 脓毒症组(24只)、JAK 激酶抑制剂（AG490）处理组(24 只)和 STAT 抑制剂（雷帕酶素，RPM）处理组(24 只). 采用逆转录多聚酶链式反应（RTPCR）测定肝 TNF mRNA 水平，酶联免疫吸附试验（ELISA）检测试剂盒检测肝 TNF 蛋白含量. 结果： 与正常对照组相比，CLP 后各时间点 TNF mRNA 升高明显（P 0.05） ，其
7、蛋白含量在 6, 24, 48 h 也增高明显（P 0.05）. AG490 和 RPM 预处理后，与 CLP 组相应时间点相比，大鼠 CLP 6, 24, 48 h 后 TNF mRNA 表达显著下降（P 0.05） ，蛋白水平也显著降低（P 0.05）. 结论： 腹腔脓毒症时TNF 表达明显升高，抑制 JAK/STAT 通路的活化可进一步下调肝组精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询织 TNF 的表达，这可能有助于防止脓毒症所致失控性炎症反应性组织损伤和多器官功能衰竭. 【关键词】 肿瘤坏死因子；脓毒症；信号传递；大鼠；Janus激酶 0 引言 脓毒症是危重病患者死亡的主要原
8、因之一，它引起的多器官功能衰竭是一个棘手的难题. 炎症介质过渡表达是作用机制之一. 细胞信号通路已成为目前研究的重点. Janus 激活/信号转导和转录激活子(janus kinase/signal transducer and activator of transcription, JAK/STAT)信号通路与脓毒症的发生发展有着密切的关系. TNF 是一种强有力的促炎细胞因子，在脓毒症的发生和发展中起着重要作用1 ，脓毒症时 JAK/STAT 通路对 TNF 表达的介导作用尚缺乏在体研究. 我们采用大鼠盲肠结扎穿孔术（cecal ligation puncture，CLP）模型探讨 JAK
9、/STAT 通路对脓毒症大鼠肝组织 TNF 表达的影响. 1 材料和方法 1.1 材料 雄性清洁级 Wistar 大鼠(由军事医学科学院实验动物中心提供) 78 只，体质量 200240 g，完全随机方法分为组， 正常对照组 (6 只)，麻醉后活杀动物； 盲肠结扎穿孔组（CLP 组，24 只） ，分别于 CLP 后 2, 6, 24, 48 h 各活杀 6 只动物； JAK 抑制剂精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询AG490 治疗组（AG490 组，24 只） ，CLP 前 0.5 h SC AG490（8 mg/kg） ； STAT 抑制剂雷帕霉素（RPM）治疗组（24 只
10、） ，CLP 前0.5 h SC RPM （0.4 mg/kg） ，和两个处理组分别在 CLP 后 2, 6, 24, 48 h 活杀动物. 各组各时间点有只动物活杀. 各组之间动物质量无显著性差异. 1.2 方法 1.2.1CLP 制作动物以 20 g/L 戊巴比妥钠 ip 麻醉后沿腹正中线作 1.5 cm 长的切口，在盲肠根部结扎盲肠. 用 18 号针在盲肠上穿通 3 次形成盲肠漏，并留置一橡皮引流条贯通盲肠以防针孔闭合. 随后，将盲肠还纳腹腔，逐层缝合腹壁切口. 术毕，立即林格液 50 mL/kg SC 抗休克. 各组动物观察至不同时相点处死并留取适量肝组织待测. 1.2.2 肝组织 T
11、NF mRNA 表达称取肝组织约 30 mg，以异硫氰酸胍一步法提取细胞总 RNA. 采用逆转录多聚酶链式反应（RTPCR）技术对转录产物进行扩增，以三磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）作为内参对照. 大鼠 TNF 序列（扩增片段为 415 bp）： 5GTA GCC CAC GTC GTA GCA AA3(上游)；5CCC TTC TCC AGC TGG AAG AC3（下游） 2 ； GAPDH 序列（扩增片段为 309 bp）： 5TCCCTCAAGATTGTCAGCAA3（上游） ；5AGATCCACAACGGATACATT3（下游） 3. 扩增产物经 20 g/L 琼脂糖凝胶电泳后照相，
12、底片采用 LEICAQ500IW 图像分析处理系统进精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询行分析，通过目的基因与内参对照的积分吸光度比值表示 mRNA 相对表达量. 1.2.3 肝组织 TNF 蛋白水平检测称取适量肝组织置于匀浆器中，加入 3 倍体积磷酸盐缓冲液，冰浴匀浆，离心后取上清液使用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测试剂盒测定 TNF 的蛋白含量. ELISA灵敏度为 5 ng/L，检测范围为 51000 ng/L. 目的蛋白在总蛋白中的含量以 ng/g 表示. 上一页 1 2 下一页统计学处理： 各项指标以 xs 表示，数据采用 SPSS10.0 统计软件包进行方差分析
13、，若组间方差不齐则进行非参数秩和检验. P 0.05 有显著性意义. 2 结果 2.1 肝组织 TNF mRNA 的表达正常大鼠肝组织 TNF mRNA 表达微弱；CLP 2 h 后表达迅速显著升高，24 h 下降几乎接近正常水平，48 h 再次显著升高（P 0.05 或 0.01, Tab 1）. AG490 和 RPM 处理后，与 CLP 组相应时间点相比，各时间点 TNF mRNA 水平均显著降低（P 0.05 或 0.01, Tab 1）.表 1AG490, RPM 对脓毒症大鼠肝组织TNF mRNA(积分吸光度比值)表达的影响（略） 2.2 肝组织 TNF 蛋白的含量正常大鼠肝组织有
14、少量的 TNF 表达，CLP 后肝组织 TNF 含量立即爆发性升高，24 h 回落到接近正常水平，48 h 再次显著升高. AG490 和 RPM 处理后大鼠 TNF 蛋白精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询表达的改变与 CLP 组相应时间点相比，各时间点 TNF 水平均显著降低（P 0.05 或 0.01, Tab 2）.表 2AG490, RPM 对脓毒症大鼠肝组织 TNF 蛋白表达的影响（略） 3 讨论 脓毒症是导致多器官功能衰竭（MODS）的重要原因之一，MODS和/或全身炎症反应综合征(SIRS)与炎症介质过渡表达紧密相关. 所以几年前围绕对 TNF 等炎症介质的活性
15、进行拮抗如 TNF 抗体，引发了大量的实验研究，虽然在动物实验中取得不错的效果，但最终在对脓毒症治疗的临床试验中归于失败4. 近年不少学者把研究的方向转向了信号传导与炎症介质之间的关系上. 脓毒症可导致机体多条信号通路活化，从而通过它直接或间接地介导炎症介质的表达. JAK/STAT 信号通路环节少而简洁，它把细胞膜上感受的信号直接传递到核内启动基因转录，因而引起研究人员的普遍兴趣. JAK有 4 个成员，JAK13, TYK；STAT 主要有 7 个成员，STAT14, STAT5a, STAT5b, STAT6. JAK 是 STAT 上游的共有激酶 . 它广泛参与了细胞应激、生长、增殖、
16、分化、凋亡等多种生物学效应. 该通路在 LPS, TNF 等炎症介质介导的炎症反应中发挥着重要作用5. TNF 在细胞凋亡中有着非常重要的意义，同时它也是一个强有力的促炎细胞因子，其表达水平的强弱与机体的免疫状态密切相关. 探索机体对 TNF 的调控机制并因此寻找对 TNF 表达的新干预手段是本实验的主要目的. 既往体内实验显示 STAT 在脓毒症时 TNF的诱生中有重要作用6. 同时体外实验发现 JAK/STAT 信号通路精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询对 TNF 的产生发挥着一定的调节作用7,8. 我们发现抑制JAK/STAT 信号通路的活化有助于减轻脓毒症大鼠肝组织的损伤9.本实验表明，脓毒症发作后早期 TNF mRNA 和蛋白水平迅速增加，最高达正常时的数倍. 但随后逐渐下降并接近正常水平，48 h 后再次强烈升高，表现为双相升高. 因此，TNF
