《噬菌体随机12肽库中VEGF模拟表位的筛选及初步鉴定-2016年最新医学论文》由会员分享，可在线阅读，更多相关《噬菌体随机12肽库中VEGF模拟表位的筛选及初步鉴定-2016年最新医学论文（13页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询噬菌体随机 12 肽库中 VEGF 模拟表位的筛选及初步鉴定【摘要】 目的： 从噬菌体随机 12 肽库中筛选能与抗血管内皮生长因子(VEGF）mAb 阿瓦斯汀(Avastin)特异性结合的多肽. 方法： 用Avastin 为靶分子，对噬菌体 12 肽库进行 3 轮生物淘洗，随机挑取80 个克隆，ELISA 法鉴定其亲和性，将亲和性高的阳性克隆进行DNA 序列测定，推导与噬菌体外壳融合的 12 肽氨基酸序列. Fmoc 固相法合成 12 肽，戊二醛交联 12 肽与血蓝蛋白（KLH） ，打点印迹（Dot blot）检测偶联物能否与 Avastin
2、 结合. 结果： ELISA 显示，42 个噬菌体克隆与 Avastin 有较强的亲和性，测序发现 41 个阳性克隆表达的融合 12 肽的序列一致，1 个不同；化学合成的 12 肽能与 Avastin 特异性结合，12 肽KLH 偶联物也能与 Avastin 特异性结合. 结论： 初步证明 12 肽模拟了 VEGF 部分表位. 【关键词】 Avastin(bevacizumab) 细菌噬菌体 肽库 血管内皮生长因子 交联0 引言精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询血管生成是肿瘤生长和转移的前提1. 血管内皮生长因子(VEGF) 是促进血管形成过程中的关键因子2-3.肿瘤组织中V
3、EGF 表达水平与肿瘤血管化的程度、恶性程度呈正相关4-5. 因此，VEGF 是肿瘤抗血管生成治疗中比较理想的靶分子. 噬菌体随机肽库含有的大量不同序列结构多肽可作为任何靶抗原表位的模拟肽，运用肽库筛选时不需要靶蛋白的任何结构，只需靶抗原的 mAb就可以获得具有免疫原性和抗原性的多肽，它们反映了抗原结合位点的特定的构像 6-7. 我们利用抗 VEGF mAb 阿瓦斯汀（Avastin）对噬菌体随机 12 肽库进行亲和筛选，旨在筛选出能与Avastin 有高亲和力的噬菌体克隆，并分析其展示的多肽序列能否模拟 VEGF 的表位.1 材料和方法1.1 材料抗 VEGF mAb Avastin(罗氏公
4、司)；噬菌体随机 12 肽库（新英格兰生物公司） ；PEG8000（华美生物公司） ；IPTG,XGal 、辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗噬菌体单克隆羊抗体(HRPantiM13 ，皮尔斯生物技术公司） ；血蓝蛋白（KLH，西格玛公司）. 550 型 ELISA 读数仪（美国伯乐公司）.精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询1.2 方法1.2.1VEGF 模拟表位肽的筛选1.2.1.1 噬菌体库的生物淘洗用 100 g/L Avastin 150 L 包被96 孔板的 1 个孔，4过夜，封闭后加入 100 L TBST 稀释 10 L 12 肽库，室温作用 1 h，用 1 ml
5、/L TBST 冲洗 10 次. 加入洗脱液(0.2 mol/L GlycineHCl,1 g/L BSA)100 L 作用 8 min，吸出洗脱液，再用 1 mol/L TrisHCl 15 L 中和上述洗脱液. 吸取 1 L 洗脱液测定滴度，其余液体加入 20 mL LB 培养基（含 ER2738 200 L，四环素贮液 20 L）进行扩增和纯化 . 按以上步骤进行第 2,3 轮筛选，但分别用 3，5 mL/L TBST 洗涤.1.2.1.2 阳性噬菌体的鉴定第 3 轮筛选完成后，挑选 80 个分割良好的噬菌体克隆分别进行扩增和纯化. 将纯化好的噬菌体分别加入预先包被了 Avastin 和
6、人 IL15 mAb（阴性对照）的 96 孔板中，室温作用 1 h；加入 HRP 标记的抗 M13（12000）抗体，作用 1 h. OPD 显色，测定 A490 nm 值，以 A490 nm 值高于阴性对照 2.1 倍作精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询为阳性克隆.1.2.1.3 阳性噬菌体与 Avastin 结合的剂量依赖实验以 5 mg/L Avastin 包被 96 孔板,每孔 100 L，同时对每个 Avastin 包被孔设立 IL15 mAb 的包被孔为阴性对照，4孵育过夜. 加入封闭液（5 mg/L BSA,0.1 mol/L NaHCO3, pH 8.6） ，
7、 4封闭 2 h，将阳性噬菌体稀释至 51014pfu/L 后作倍比稀释（pfu：噬菌斑形成单位） ，直至其滴度为 1.91010pfu/L ，分别加入 Avastin 及 IL15 mAb 包被孔，100 L/孔，室温孵育 2 h，每孔加入 HRP 标记的小鼠抗 M13噬菌体 mAb（15000）100 L，室温孵育 1 h，OPD 显色后测定A490 nm 值.1.2.1.4 阳性噬菌体单链 DNA 的提取及测序取 500 L 上述噬菌体贮液，加入 200 L PEG8000/NaCl 放置 10 min，离心 10 min，弃上清，沉淀重悬于 100 L 碘化物缓冲液中，加入 250 L
8、 乙醇，室温作用 100 min，离心 100 min，弃上清，用 700 mL/L 乙醇洗沉淀，短暂真空干燥. 沉淀重悬于 30 L TE(0.01 mol/L TrisHCl ，1 mmol/L EDTA)中，取上述溶液 5 L 送上海生工生物公司测序.精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询1.2.2 人工合成 12 肽与 Avastin 结合的剂量依赖实验将不同稀释度的合成 12 肽加入对应的孔中（初始浓度为 16 g/L，倍比稀释至终浓度为 0.25 g/L） ，每孔 100 L ,4过夜；封闭 2 h，将Avastin 和 IL15 mAb 分别加入对应孔中,每孔 10
9、0 L，室温反应1 h；每孔加入小鼠抗人 IgG 抗体（11000) 100 L，室温反应 1 h；每孔加入 HRP 标记的山羊抗小鼠抗体（15000) 100 L，温孵育 1 h，OPD 显色后测 A490 nm 值.1.2.3 人工合成 12 肽与 KLH 偶联8将 10 mg KLH 融于 2 mL pH 10 的硼酸盐缓冲液中，温和震荡，加入 12 肽 15 mg，缓慢滴入3 mL/L 戊二醛溶液 1 mL，震荡 2 h 至溶液变为黄色，加入 1 mol/L甘氨酸作用 30 min. 将反应物在 pH 8.5 的硼酸盐缓冲液中 4透析过夜，更换缓冲液继续透析 4 h.1.2.4 偶联物
10、的 Dot blot 鉴定9取 12 肽KLH 偶联物 5 L，缓慢点在 NC 膜上，待干透以后，以含 2 g/L BSA 的 TBS（pH 7.3）封闭 2 h. 5 mL/L TBST 洗涤 3 次，每次 510 min. 加入 10 mg/L Avastin 室温孵育 2 h. TBST 同法洗涤后，加入 AP 羊抗人二抗，室温孵育 1 h. 洗涤后显色，以不加戊二醛的反应体系产生的精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询蛋白及无关 12 肽KLH 偶联物为对照.1.2.5 分光光度法计算偶联物的结合比取 KLH 溶液、12 肽溶液、结合物溶液，分别测定其 A280 nm 值
11、，根据朗伯 比尔定律计算 3种溶液在 280 nm 处摩尔吸光系数 . 由光的加合性原理可知 结合物=12 肽+KLH ，结合物中 KLH 与 12 肽的结合比由以下公式计算：结合比= （ 结合物-KLH）/12 肽.上一页 1 2 下一页2 结果2.1 噬菌体库生物淘洗在 3 轮生物淘洗中，阳性噬菌体的得率逐渐增大(表 1)，表明所淘选的噬菌体得到了选择性的富集.表 1 亲和淘选对噬菌体的富集（略）2.2 阳性噬菌体克隆的鉴定 ELISA 结果显示 80 个噬菌体克隆中有 42 个噬菌体可以较好地与 Avastin 结合，而不与对照 IL15 精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页
12、查询mAb 结合，确定这 42 个为阳性噬菌体克隆(图 1).图 1 阳性噬菌体克隆与抗体的结合力（略）2.3 阳性噬菌体特异性分析随着阳性噬菌体投入量的增大，A490 nm 值也增大，表明噬菌体与 Avastin 的结合呈剂量依赖性，也表明阳性噬菌体与 Avastin 的结合为特异性（图 2）.2.4 阳性噬菌体克隆测序对 42 个阳性噬菌体克隆进行 DNA 序列测定，根据所测得的 DNA 序列推导其所编码的融合 12 肽氨基酸序列，发现 41 个阳性克隆所展示的 12 肽具有同样的序列,一个噬菌体展示的序列不同.图 2 阳性噬菌体与 Avastin 结合的剂量依赖试验 （略）2.5 人工合
13、成 12 肽与 Avastin 结合的剂量依赖性化学合成的 12肽可与 Avastin 特异性结合，该结合呈剂量依赖性(图 3).精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询图 3 人工 12 肽与 Avastin 结合呈剂量依赖关系（略）2.6 偶联物 Dot blot 结果及结合比 12 肽KLH 偶联物与Avastin 可特异性结合（图 4） ，偶联物中 12 肽与 KLH 的结合比为520.1：12 肽KLH 偶联物； 2：KLH； 3：无关对照 12 肽KLH 偶联物.图 412 肽KLH 偶联物与 Avastin 结合的 Dot blot 鉴定（略）3 讨论Avastin
14、是针对 VEGF 的第一个上市的单克隆抗体，它具有良好的抗肿瘤及抗血管生成效果10-12 ，然而 Avastin 又存在价格昂贵、不良反应较多等缺点，从而限制了其应用，如果能找到 VEGF 的精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询表位，并以此构建针对 VEGF 的自体疫苗，便可避免 mAb 的诸多缺点. 噬菌体展示技术，多肽人工合成技术和蛋白质化学偶联技术为构建这种疫苗提供了平台，已有研究者应用这些技术成功构建了自体疫苗，如 Angelika 使用 Cetuximab 筛选了 EGFR 的模拟表位，构建了针对 EGFR 的自体疫苗13.按照以上思路构建的 VEGF 模拟多肽制备疫
15、苗，与传统的直接用重组的人 VEGF 作为抗原刺激机体相比具有以下优点：制备简单，价格低廉；避免了 VEGF 潜在的引起肿瘤的作用；性质稳定，无内毒素和感染源等.我们用 Avastin 对噬菌体随机 12 肽库进行了 3 轮生物淘洗，在特异性噬菌体得到富集后，随机挑选 80 个噬菌体克隆，确证其中42 个噬菌体克隆与 Avastin 具有较高的亲和性，然后提取噬菌体DNA 后进行序列分析，发现有 41 个噬菌体表达的融合 12 肽序列完全一致，这一结果提示该 12 肽模拟了 VEGF 的表位. 但同时发现这41 个噬菌体与 Avastin 的结合力却有差异，分析原因是噬菌体在扩增后滴度不同，导
16、致等体积噬菌体悬液与 Avastin 的结合力不同. 我们将在下一步试验中优化扩增噬菌体的条件，使扩增后的噬菌体滴度一致，从而减少这种差异.精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询在本实验中，我们直接合成了筛选的 12 肽，但由于合成的 12 肽所处的环境与表达在噬菌体表面时不同，所以阳性噬菌体虽然能与Avastin 结合，而我们仍然要验证合成的 12 肽能否与 Avastin 结合，结合试验表明合成的 12 肽能够与 Avastin 结合，且结合呈剂量依赖性， 12 肽脱离噬菌体后性质不变.12 肽是小分子物质，分子量只有 1700 ku，抗原性很弱，不能直接诱导机体产生体液免疫反应，因此必须将 12 肽与分子量大的载体蛋白连接，使之具备抗原性. 载体和连接方法的选择我们采取了以下原则14：12 肽的氨基酸组
