《噬菌体展示技术筛选幽门螺杆菌空泡毒素（VacA）基因结合蛋白-2016年最新医学论文》由会员分享，可在线阅读，更多相关《噬菌体展示技术筛选幽门螺杆菌空泡毒素（VacA）基因结合蛋白-2016年最新医学论文（4页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询噬菌体展示技术筛选幽门螺杆菌空泡毒素（VacA）基因结合蛋白【关键词】噬菌体展示；幽门螺杆菌；空泡毒素（VacA） ；结合蛋白 0 引言 我们应用噬菌体展示技术，以幽门螺杆菌(HelicobacterPylori,Hp)VacA 基因片段作为固相筛选分子，筛选幽门螺杆菌 VacA 基因结合蛋白,探索 VacA 致病机制，研究 VacA 致病机制，为 HP 疫苗的研制和治疗等提供依据. 1 材料和方法 1.1 材料 T7select 人胃细胞 cDNA 文库，受体菌 BLT5615（Novagen 公司） ，质粒 pGEMTeasy （Prom
2、ega 公司） ，Taq 酶、琼脂糖,dNTP,T4 连接酶、RNA 酶，玻璃奶 DNA 回收试剂盒（博大科技） ，BamHI,SacI 等限制性内切酶（购于宝生物公司） ，热循环仪、凝胶成像仪、大肠杆菌DH5 为本实验室保存,引物合成与核苷酸序列分析由大连宝生物公司完成. 1.2 方法 1.2.1Hpvaca 基因扩增1采用 PrimerDesigner 引物设计软件设计，大连 TaKaRa 公司合成.在上下游引物的 5 端分别引入BamHI,SacI 限制性酶切位点，其中上游引物 5端用生物素标记.上游引物：5TTGGATCCGAAATACAACAAACACACCT3 ，下游引物：精品文档
3、欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询5AAGAGCTCAGATTTTTGGAAACCACCTT3. 产物回收纯化. 1.2.2 文库扩增摇菌 BLT5615 至 A600nm 值 0.5，加入IPTG，30min 后加入噬菌体文库 4L，37振摇直到细菌裂解，将裂解液 4保存. 1.2.3 生物筛选链亲和素包被微孔板，4过夜；1TBS 洗涤，加入 vacA 基因回收片段，4过夜；1TBST 洗涤，加入文库扩增裂解液，4过夜；1TBST 洗板，加入 200LT7 洗脱缓冲液，手摇室温孵育 20min，取 10L 洗脱噬菌体加入 3mLBLT5615 细菌培养液，37振摇培养，直到细菌裂解
4、.收集裂解液 4离心取上清 4保存备下一轮筛选用.按上述步骤再筛选 3 遍.第二、三、四轮筛选分别以前一轮的裂解液代替文库扩增裂解液，每轮筛选后，均做噬斑分析. 1.2.4 噬斑的 PCR 扩增取第 4 轮筛选后的阳性噬斑，进行噬菌体裂解，将噬斑裂解液 PCR 扩增，上游引物：5GGAGCTGTCGTATTCCAGTC3; 下游引物:5AACCCCTCAAGACCCGTTTA3. 扩增条件：94变性 60s,50退火 55s,72延伸 60s,循环 35 次后，72保温 10min.10g/L 琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增结果，玻璃奶法回收 DNA 片段. 1.2.5 序列比对和同源性分析 选择不同
5、长度且出现频率较高纯化的 PCR 产物与 pGEMTeasy 载体混合，在 16条件下用 T4DNA 连接酶连接过夜，随后转化用氯化钙法制备的大肠杆菌 DH5 感受态细胞，在铺有 IPTG/Xgal 的氨精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询苄西林平板上进行蓝白斑菌落筛选，挑取白色菌落用 T7 引物鉴定，序列测定由大连宝生物公司完成.同源性搜索由以下网址上的BLASTn 软件完成（http：/www.ncbi.nlm.nih.gov/blastn）. 上一页 1 2 下一页2 结果 2.1HPvacA 基因扩增（图 1）. 2.2 胃细胞 cDNA 文库的筛选以固相化的 HPva
6、cA 基因片段作为支持分子，对人胃细胞 cDNA 文库进行 4 轮“吸附 洗脱 扩增”的筛选.噬菌体的富集结果从固相平板洗脱的噬菌体数显示了明显的增加趋势（表 1）.表 1 亲和筛选对噬菌体的富集（略） 2.3 目的基因的 PCR 扩增经过 4 轮筛选，随机挑取 46 个噬斑为模板，用 T7select 引物进行 PCR 扩增，PCR 产物用 10g/L 琼脂糖凝胶电泳.结果产生大小不等的条带（图 2） ，用同一噬斑裂解液重复PCR 得到同样结果. 2.4 序列比对和同源性分析 对阳性克隆基因的 DNA 序列测定，并用 BLASTn 程序进行同源性搜索，共编码 3 种已知蛋白：核仁磷蛋白 B2
7、3、抗氧化蛋白 2、二硫化蛋白异构酶 A2. 3 讨论 噬菌体展示技术为研究 DNA 结合蛋白开辟了新的研究策略和技术途径2-3.Novagen 公司构建的 T7Select 载体是将外源性 DNA 序精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询列插入到 T7 噬菌体的包膜蛋白上，组建了 3 种不同表达强度的载体，外源 cDNA 来自人胃细胞，插入片段长度在 3003000bp 之间，该展示文库的特点是可以展示相当部分正常胃组织正在表达的蛋白质，甚至可以保持蛋白一定的空间构象，因此，该系统最大程度上再现了细胞内蛋白的真实情况，该系统筛选出的配体蛋白与自然状态较为接近.且该系统移框突变位
8、点被去除，因此重组载体将仅表达一种蛋白并构成包膜蛋白. 本试验用噬菌体人胃 cDNA 文库筛选得到幽门螺杆菌 vacA 基因DNA 结合蛋白的基因片段，抗氧化蛋白 2、二硫化蛋白异构酶 A2 为胃正常组织表达蛋白，有报道核仁磷蛋白 B23 在胃癌中表达下调，可以对筛选出的蛋白进行进一步的分析，为研究 vacA 致病机制，为HP 疫苗的研制和治疗等方面起作用提供依据. 致谢：北京地坛医学院成军教授在实验技术操作方面给与了很大的帮助和支持，在此表示感谢！ 【参考文献】 1汪雪峰，王克霞.球形幽门螺杆菌 vaca 基因的克隆及序列测定J.南京医科大学学报，2003，24（7）：351-355. 2陈琳，王克霞.噬菌体展示技术在幽门螺杆菌研究中的作用J.中国人兽共患病杂志，2006,22(2)：179-183. 3曲建慧，成军，张玲霞，等.噬菌体展示技术筛选干扰素精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询 启动子 DNA 结合蛋白J.中华肝脏病杂志，2005，13（7）：520-523. 上一页 1 2 下一页
