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1、1CTGF mRNA 在糖尿病大鼠心肌中的表达及葛根素和氨基胍的调节作用【摘要】 目的 ：观察结缔组织生长因子(CTGF)在糖尿病大鼠心肌组织中的表达情况及葛根素(Pue)、氨基胍(AG)对 CTGF 表达的调节作用。方法：给大鼠腹腔注射链脲佐菌素(STZ)制备糖尿病模型，用葛根素(Pue1 组，160 mgkg-1d-1;Pue2 组，120 mgkg-1d-1;Pue3 组， 80 mgkg-1d-1)、氨基胍(AG 组，100 mgkg-1d-1)治疗 12 周;采用 RT-PCR 检测心肌组织 CTGF mRNA 的表达，透射电镜下观察心肌细胞的形态学改变。结果：糖尿病组大鼠心肌组织C
2、TGF mRNA 的表达升高，Pue2 组、Pue3 组和 AG 组 CTGF mRNA 的表达明显降低;电镜下可见糖尿病组大鼠心肌细胞肌原纤维含量明显减少，治疗组大鼠心肌病变明显减轻。结论：葛根素(120和 80 mgkg-1d-1)和氨基胍能下调 CTGF mRNA 的表达，对糖尿病大鼠心肌具有保护作用。 【关键词】 结缔组织生长因子;葛根素;氨基胍;糖尿病;心肌;基因;大鼠Abstract: Objective: To observe the mRNA expression of the connective tissue growth factor(CTGF) in myocardia
3、l tissue in rats with diabetes mellitus (DM) and the adjusling 2effects of puerarin (Pue) and aminoguantdine (AG) on CTGF expression.Methods: The diabetes mellitus (DM) rats models were made by intraperitoneal injection of streptozotocin (60 mg/kg body weight)， then treated with Pue and AG. After 12
4、 weeks， the rats were sacrificed. The expression of CTGF mRNA of myocardial tissue were determined with reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR). Morphology of myocardium of rats were also observed under transmission electron microscope (TEM). Results: The CTGF mRNA expres-sion was s
5、ignificantly higher in DM group than those in NC group and Pue treated(120 mgkg-1d-1、80 mgkg-1d-1)and AG treated groups (P0.01). It showed that myofibrilla contents in myocardial cell decreased significantly under TEM in diabetic group. The pathological changes of myocardium which induced by diabete
6、s were reversed in different doses of Pue treated groups and AG treated groups. Conclusion: The protective effect of Pue and AG on myocardium of diabetic rat may be down-regulated through decreasing the level of CTGF mRNA expression.Key words: connective tissue growth factor;puerarin;aminoguanidine;
7、diabetes mellitus; 3myocardium;gene expression;rat糖尿病心肌病(DCM)是糖尿病最常见的慢性并发症之一，被认为是糖尿病死亡的首要因素。已有研究表明，糖尿病心肌病变以舒张功能异常为早期临床特征，间质纤维化是其发生的主要原因1。结缔组织生长因子(CTGF)是新近发现的与纤维化形成密切相关的细胞因子2。近年来有研究提示 CTGF 参与了心肌纤维化的发生3-4。本研究观察了 CTGF 在糖尿病大鼠心肌组织中的表达情况以及葛根素和氨基胍对 CTGF mRNA 表达的影响。1 材料和方法1.1 动物、试剂与仪器 清洁级(II 级)Sprague-Dawle
8、y 大鼠70 只，体重 180220 g，2 月龄(本院实验动物中心提供)。链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)、氨基胍均为美国 Sigma 公司产品，葛根素注射液(2 mL:0.1 g)为浙江康恩贝制药有限公司产品 ;Trizol reagent RNA 提取试剂盒、RT-PCR 试剂盒、DNA Marker 由宝生物工程(大连 )有限公司提供 ;CTGF 及 GAPDH(3-磷酸甘油醛脱氢酶)引物序列由上海生物工程技术服务有限公司合成;血糖仪及测试条由强生(中国)医疗器材有限公司提供。1.2 动物分组和处理 随机取 10 只大鼠作为对照组(C 组)，4余 60 只大鼠禁食 1
9、2 h 后，用链脲佐菌素 60 mg/kg 一次性左下腹腔注射，72 h 后取尾血用快速血糖仪测血糖，16.8 mmol/L 为糖尿病大鼠。成模后再将糖尿病大鼠随机分为 5 组：糖尿病组(DM 组)、葛根素高剂量(160 mgkg-1d-1)治疗组(Pue1 组)、葛根素中剂量(120 mgkg-1d-1)治疗组(Pue2 组)、葛根素低剂量 (80 mgkg-1d-1)治疗组(Pue3 组) 、氨基胍治疗组(AG 组，100 mgkg-1d-1)。C 组及 DM 组每天腹腔注射丙二醇，容积为 2 mL/kg，其余各组大鼠每天在相同时间内腹腔注射相应的药物，于同等条件下饲养 12周。大鼠给药处
10、理 12 周后，股动脉放血处死，开胸取出心脏，留取电镜标本后，迅速用 4 生理盐水冲洗血液，放入液氮中速冻过夜后移至-70 冰箱中保存备用。1.3 心肌组织 CTGF mRNA 表达的测定 取冻存的心肌组织，经 Trizol 一步法提取总 RNA，紫外分光光度法定量后，按照逆转录试剂盒说明，以 Oligo(dT)为引物合成 cDNA，于-20 保存备用。根据 Genebank 资料，以 CTGF mRNA 和 GAPDH mRNA 为模板，用软件 Primer 3 设计引物如下：CTGF 上游 5-GCAAATAGCCTGTCAATCTC-3，下游 5- TCCATAAAAATCTGGCTTG
11、T-3，扩增产物长度为 414 bp;GAPDH 上游 5-ACTCAGAAGACTGTGGATGG-3，下游5-TGTTGAAGTCACAGGAGACA-3，产物长度为 313 bp。优化 PCR 条件，进行 CTGF 与 GAPDH 的共扩增。扩增产物经 1.5%5琼脂糖凝胶电泳后用凝胶成像仪观察，用 Image Master 软件半定量分析条带峰面积，计算 CTGF 与 GAPDH 峰面积的比值。1.4 心肌组织超微结构观察 大鼠处死后立即取左心室心肌，用锋利双刃刀片切成 1 mm 1 mm 1 mm，迅速置 2.5%戊二醛于 4 固定 1 h，于常规 PBS 漂洗、丙酮梯度脱水， Ep
12、on812 包埋，LKB-V 型超薄切片机切片，铅铀双重染色，HITACHI 7500 型透射电镜下观察。1.5 统计学处理方法 采用单因素方差分析，组间两两比较采用 LSD 检验。2 结果2.1 各组大鼠心肌组织 CTGF mRNA 表达的变化 DM 组CTGF mRNA 表达显著高于 C 组(P0.05);Pue2 、Pue3 组明显低于 DM 组(均P0.05);AG 组明显低于 DM 组，但仍高于 C 组( 均 P0.01)。见表 1 和图 1。2.2 各组大鼠心肌组织超微结构的变化 C 组大鼠心肌间无胶原沉积。DM 组大鼠心肌纤维外间隙增宽，内中胶原纤维沉积。 AG组大鼠心肌血管周围
13、有局灶性胶原纤维增生。Pue1 组心肌纤维间局6灶性胶原纤维增生。Pue2 组心肌血管周围没有胶原纤维增生。Pue3 组心肌纤维间隙小，无胶原纤维增生。见图 2。3 讨论近年来，有关 DCM 的发病机制研究中，细胞因子网络逐渐成为人们的研究热点。CTGF 是一种富含半胱氨酸的分泌性多肽，是近年发现的一种新的致纤维化生长因子，具有广泛的生物学作用。它可促进细胞的黏附、增生和细胞外基质形成，参与细胞周期调控、血管发生、心血管重构及多种脏器的纤维化过程。在生理情况下，心、脑、肾等组织中可有基础量的 CTGF 分泌，而在高血压、动脉粥样硬化病变中以及心肌梗死灶中 CTGF 表达明显增高，并与纤维化指标
14、呈正相关，提示 CTGF 可能是致心肌纤维化的关键性中间环节5-6。赖鹏斌等7发现，糖尿病大鼠心肌 CTGF mRNA 表达显著上调，随着病程延长呈逐渐增高趋势，并与纤维连接蛋白、型胶原的表达水平升高相关。本实验结果也表明，糖尿病组大鼠CTGF mRNA 表达显著增强，提示 CTGF 参与糖尿病心肌纤维化的过程。葛根素(Puerarin， Pue)是从豆科多年生落叶藤本植物野葛或甘葛藤的根中提取的单体异黄酮化合物，其化学名为 8-D-葡萄吡喃糖-4 ，7-二羟基异黄酮。现代药理研究表明，Pue 能扩张冠脉，7降低血液黏度，抑制血小板凝集，降低血栓素 A2 的水平，改善心肌的缺血、低氧;并能抑制
15、蛋白非酶糖基化，抗氧自由基损害8-9，调节血脂，降低血糖，其对糖尿病的治疗作用正逐渐受到重视。本实验结果显示，糖尿病大鼠予以葛根素 120 mgkg-1d-1、80 mgkg-1d-1 治疗 12 周后，心肌 CTGF mRNA 表达明显降低，提示适当剂量的葛根素能在一定程度上延缓糖尿病大鼠心肌的纤维化进程。AG 为亲核肼类化合物，能通过抑制 AGEs 形成及阻止 AGEs与受体的相互作用而减少 CTGF 表达10。本实验中，AG 组与 DM组比较 CTGF mRNA 表达亦显著下降，可能是通过以上机制起作用。而葛根素对 CTGF mRNA 表达的作用机制尚需进一步研究探讨。【参考文献】1Da
16、vid S, Bell H, Face MB.Diabetic cardiomyopathyJ.Diabe-tes Care,2003,26:2949-2951.2Wahab NA,Yevdokimova N,Weston BS,et al.Role of con-nective tissue growth factor in the pathogensis of diabeticnephropathyJ.Biochem J, 2001, 359(1):77-87.3Ahmed MS, Oie E,Vinge LE, et al. Connective tissue growthfactor a novel mediator of angiotensin II-
