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1、DNS法测定淀粉酶活力的方法,1,DNS-淀粉酶活力的方法,DNS法测定淀粉酶活力的方法,2,目的要求,了解生物学研究中针对糖含量测定的常用方法及相关原理。 掌握一般标准曲线制作的意义及要求。 掌握DNS比色法测定-淀粉酶活力的原理、方法及操作步骤。 掌握利用EXCEL分析工具库数据分析回归分析，得到回归方程及相关分析结果。,DNS法测定淀粉酶活力的方法,3,糖的测定方法,大致可分为三类： 1.物理法旋光法、折光法、比重法； 2.物理化学法点位法、极普法、光度法、色谱法； 3.化学方法斐林氏法、高锰酸钾法、碘量法、铁氰化钾法、DNS比色法、蒽酮比色法、咔唑比色法,DNS法测定淀粉酶活力的方法,
2、4,生物学研究中关于糖测定中常用的方法,菲林试剂滴定还原糖，常量分析 DNS比色法还原糖，微量分析 蒽酮比色法总糖，微量分析,DNS法测定淀粉酶活力的方法,5,配制系列浓度稀释液的方法,线性稀释稀释液的浓度梯度是相同的（0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0）； 对数稀释（倍数稀释）系列溶液的浓度比是一常数，取决于稀释梯度2倍稀释（1、1/2、1/4、1/8）；10倍稀释（1、1/10、1/100、1/1000）； 调和浓度稀释系列溶液的浓度为连续排列整数的倒数（1，1/2，1/3，1/4，1/5）。,DNS法测定淀粉酶活力的方法,6,-淀粉酶酶活力测定的原理,底物（反应物）为淀粉碘比色法
3、（反应一定量淀粉为糊精的时间） 产物为麦芽糖、糊精等麦芽糖为还原糖，可以用测定还原糖的方法来测定其生成量（如DNS法），从而计算出酶活力单位。,DNS法测定淀粉酶活力的方法,7,DNS试剂测定还原糖的原理,淀粉酶催化产生的还原糖（麦芽糖等）能使3,5-二硝基水杨酸还原，生成棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸，其反应如下：,淀粉酶活力的大小与产生的还原糖的量成正比。用标准浓度的麦芽糖溶液制作标准曲线，用比色法测定淀粉酶作用于淀粉后生成的还原糖的量，以单位样品（重量或体积）在一定时间内生成的麦芽糖的量表示酶活力。,DNS法测定淀粉酶活力的方法,8,酶活力测定（DNS比色法）,酶活力定义：在一定反应条
4、件下（本实验为40 ，pH5.6或6.0），1分钟反应生成1mg麦芽糖的酶量定义为1个酶活力单位。 注意：去除-淀粉酶的干扰（ -淀粉酶不热耐，在7015min钝化 ）植物材料来源需要注意。本此实验中忽略不计。 检测的原理： 酶解的产物之一麦芽糖具有还原性，可以使试剂中的3，5-二硝基水杨酸还原，形成红色的物质，在540nm下有吸收峰，并和浓度呈一定线性关系。 计算公式：根据标准曲线计算。,DNS法测定淀粉酶活力的方法,9,3，5-二硝基水杨酸（DNS）试剂配制说明,21g 氢氧化钠（先加入溶解）； 182g 酒石酸钾钠（同上）； 6.3g DNS（3，5-二硝基水杨酸），加热完全溶于上述溶液
5、中； 5g 重蒸苯酚（冷却后加入）； 5g 无水亚硫酸钠（冷却后加入）； 完全溶解后定容至1000ml，贮存时间越长越稳定。 引自： 朱俭，曹凯鸣，周润琦，蔡武城，袁厚积编著生物化学实验上海：上海科学技术出版社，1981,DNS法测定淀粉酶活力的方法,10,标准曲线法,取标准品配成一系列已知浓度的标准溶液，在选定波长处（通常为max），用同样厚度的吸收池分别测定其吸光度，以吸光度（OD）为纵坐标，系列标准溶液浓度为横坐标作图，得到一通过坐标原点的直线标准曲线（工作曲线）。 理想的标准曲线满足以下条件： 1、至少5个点，一般不超过7个点； 2、2个以上重复值； 3、重复值误差小于5%； 4、点与
6、线的垂直距总和最小； 注意：标准曲线不能任意延长！（有一定测定范围）,DNS法测定淀粉酶活力的方法,11,理想标准曲线的特点,过原点的直线； 斜率为1（45）； 浓度为待测物质浓度的一半二倍； OD值在0.050.8之间（最好控制在0.2 0.6）。,mg/ml,DNS法测定淀粉酶活力的方法,12,麦芽糖标准曲线的制作,取6支干净的具塞刻度25mL比色管，编号，按下表中加入相关试剂； 混匀后，置沸水浴中煮沸5min。取出后流水冷却，加蒸馏水定容至25mL。以1号管作为空白调零点，在540nm波长下比色测定光密度。以麦芽糖含量（mg）为横坐标，吸光度（OD）为纵坐标，绘制标准曲线。沸水浴时不要加
7、塞！ 利用Excel中相关统计分析工具，完成回归方程的计算及分析，并绘制标准曲线图。,DNS法测定淀粉酶活力的方法,13,相关试剂（第一种）,标准麦芽糖溶液（1mg/mL）：精确称取1g麦芽糖，用蒸馏水溶解并定容至1000mL。 0.1mol/L pH5.6的柠檬酸缓冲液：称取柠檬酸（C6H8O7H2O ）5.78g，柠檬酸钠（Na3C6H5O72H2O）21.32g ，用蒸馏水溶解并定容至1000mL。 1%马铃薯淀粉溶液：称取1g马铃薯淀粉（105烘干2hr）溶于100mL 0.1mol/L pH5.6的柠檬酸缓冲液中（一般需要密封121.3 灭菌处理20min）。,DNS法测定淀粉酶活力
8、的方法,14,相关试剂（第二种）,标准麦芽糖溶液（1mg/mL）：精确称取1g麦芽糖，用蒸馏水溶解并定容至1000mL。 0.2mol/L pH6.0 磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液：称取磷酸氢二钠（Na2HPO4.12H2O）45.3g，柠檬酸（C6H8O7H2O ）7.74g，先在烧杯中用蒸馏水使之溶解，然后转入容量瓶中定容至1000mL。 1%马铃薯淀粉溶液：称取1g马铃薯淀粉（105烘干2hr）溶于100mL 0.2mol/L pH6.0 磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中（一般需要密封121.3 灭菌处理20min）。用时注意酶污染。,DNS法测定淀粉酶活力的方法,15,标准曲线制作相关试剂加入表
9、,加入完成混匀后沸水浴5min，定容至25mL混匀比色。,DNS法测定淀粉酶活力的方法,16,预留发酵液酶活力测定需要稀释倍数,10、100、1000、10000、50000 对照设置1个就可以，10或100倍； 按照DNS方法测定。,DNS法测定淀粉酶活力的方法,17,酶活力测定步骤（流程）,1ml稀释酶液,40水浴保温5min,加入2.0mlDNS,1ml稀释酶液,40水浴保温10min,加入2.0mlDNS,40水浴保温10min,沸水浴5min,沸水浴5min,冷却定容至25ml,冷却定容至25ml,540nm比色测定OD值,540nm作比色调“0”、“100”用,加入1.0ml1%淀
10、粉溶液 （预先40水浴保温5min）,加入1.0ml1%淀粉溶液 （预先40水浴保温5min）,40水浴保温5min,代入回归方程计算出麦芽糖生成量,DNS法测定淀粉酶活力的方法,18,计算公式,N-酶液稀释倍数 10-反应时间为10min 注意：标准曲线、酶活力比色测定时使用玻璃比色皿（可见光比色）,酶活力定义：在一定反应条件下（本实验为40 ，pH5.6或6.0），1分钟反应生成1mg麦芽糖的酶量定义为1个酶活力单位。,DNS法测定淀粉酶活力的方法,19,预留发酵液紫外分光光度法测定蛋白质含量的稀释要求,酶溶化后稀释至50100倍测定A280和A260；以蒸馏水为对照。 代入Lowry-K
11、alckar经验公式： 蛋白质含量（mg/mL）=（1.45A2800.74A260）N 注意：使用石英比色皿测定（紫外光比色用？），石英比色皿较贵，损坏要赔偿！,DNS法测定淀粉酶活力的方法,20,比酶活力计算,定义：1mg蛋白质的酶活力单位。 计算公式：,说明： 样品测定得到酶活力单位（U/mL）和蛋白质含量（mg/mL）。 可以反映样品中酶的纯度。,DNS法测定淀粉酶活力的方法,21,分光光度计介绍,原理：在一定条件下，遵循朗伯比尔（Lambert-Beer）定律 组成：光源、单色器（棱镜、光栅）、吸收池、检测器（光电管、光电倍增管、光电二极管阵列）、显示系统,DNS法测定淀粉酶活力的方法,22,朗伯比尔定律,朗伯-比尔定律,透光度T：,吸光度A：,定义,光吸收基本定律（郎伯-比尔定律）,DNS法测定淀粉酶活力的方法,23,朗伯比尔定律,朗伯-比尔定律,郎伯-比尔定律表达式,A：吸光度；对光的吸收程度 b：液层厚度，单位cm c：溶液的浓度，molL- ：摩尔吸收系数，Lmol-cm-,如果c单位：gL- 则吸收系数为a， 单位：Lg-cm-,
