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1、精选课件,1,PCR基因扩增仪 (PCR Gene Amplifier),精选课件,2,内容提要,1. PCR基因扩增仪的工作原理 PCR技术的原理及发展 PCR基因扩增仪的工作原理 2. PCR扩增仪的分类与结构 定性PCR扩增仪 实时荧光定量PCR扩增仪 3. PCR扩增仪的性能指标、操作规程 PCR扩增仪的性能指标 PCR扩增仪的操作规程 4. PCR扩增仪的应用,精选课件,3,第一节 PCR基因扩增仪的工作原理,一、PCR技术的发展 Khorana (1971)等最早提出核酸体外扩增的设想:“经DNA变性,与合适的引物杂交,用DNA聚合酶延伸引物,并不断重复该过程便可合成tRNA基因。
2、” 1985年,Kary Mullis在Cetus公司工作期间,发明了PCR。Mullis要合成DNA引物来进行测序工作,却常为没有足够多的模板DNA而烦恼。 1983年4月的一个星期五晚上,他开车去乡下别墅的路上,猛然闪现出“多聚酶链式反应”的想法。 1985年10月25日申请了PCR的专利,1987年7月28日批准(专利号4,683,202 ),Mullis是第一发明人; 1985年12月20日在Science杂志上发表了第一篇PCR的学术论文,Mullis是共同作者; 1986年5月,Mullis在冷泉港实验室做专题报告,全世界从此开始学习PCR的方法。,聚合酶链式反应(PCR)是一种用
3、于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术,它可看作是生物体外的特殊DNA复制,PCR的最大特点,是能将微量的DNA大幅增加。因此,无论是化石中的古生物、历史人物的残骸,还是几十年前凶杀案中凶手所遗留的毛发、皮肤或血液,只要能分离出一丁点的DNA,就能用PCR加以放大,进行比对。这也是“微量证据”的威力之所在。,精选课件,4,第一节 PCR基因扩增仪的工作原理,二、PCR技术的原理 体外核酸扩增,加热使双链DNA解开螺旋,在退火温度条件下引物同模板DNA杂交,在Taq DNA聚合酶,dNTPs(脱氧核糖核苷三磷酸),Mg2+和合适pH缓冲液存在条件下延伸引物,重复 “变性退火引物延伸”过程至2
4、5-40个循环,呈指数级扩大待测样本中的核酸拷贝数。 简单的说,PCR仪就是利用DNA聚合酶对特定基因做体外或试管内的大量合成,基本上它是利用DNA聚合酶进行专一性的连锁复制。目前常用的技术,可以将一段基因复制为原来的一百亿至一千亿倍。,精选课件,5,第一节 PCR基因扩增仪的工作原理,模板DNA的变性:模板DNA经加热至93左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备,模板DNA与引物的退火(复性):模板DNA经加热变性成单链后,温度降至55左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合;,DNA模板与引物结合物在TaqD
5、NA聚合酶的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链,重复循环变性-退火-延伸三过程,就可获得更多的“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需24分钟,23小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍,精选课件,6,第一节 PCR基因扩增仪的工作原理,PCR基因扩增仪的工作关键 DNA聚合酶在高温时会失活,因此,每次循环都得加入新的DNA聚合酶,不仅操作烦琐,而且价格昂贵,制约了PCR技术的应用和发展。 从PCR反应基本原理可以看出,PCR基因扩增仪工作关键是温度控制。,精选课件,7,第一节 PC
6、R基因扩增仪的工作原理,精选课件,8,第二节 PCR扩增仪的分类与结构,精选课件,9,第二节 PCR扩增仪的分类与结构,荧光实时定量PCR(real-time quantitative PCR,RQ-PCR)技术 在PCR反应体系中加入特异性的荧光染料或探针 荧光信号的变化真实地反映了体系中模板的增加 通过检测荧光信号,从而实时监测整个PCR反应过程 最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析,精选课件,10,第二节 PCR扩增仪的分类与结构,精选课件,11,第二节 PCR扩增仪的分类与结构,金属板式实时定量PCR仪 可作为普通PCR仪使用 可带梯度功能 可容纳的样本量大,无需特殊耗材 温度均一性
7、欠佳,有边缘效应,标准曲线的反应条件难以做到与样品完全一致,精选课件,12,第二节 PCR扩增仪的分类与结构,ABI 7500荧光定量PCR仪,MJ公司Chromo 4荧光定量PCR仪,Bio-rad公司iCycler荧光定量PCR仪,精选课件,13,第二节 PCR扩增仪的分类与结构,离心式实时定量PCR仪 温度均一性较好 使用的是同一个激发光源和检测器,随时检测旋转到跟前的样品,有效减少系统误差 可容纳样品量少,有的需用特殊毛细管作样品管,增加了使用成本,也不带梯度功能,精选课件,14,第二节 PCR扩增仪的分类与结构,Rotor-Gene 3000荧光定量PCR仪,Light CycleT
8、M荧光定量PCR仪,精选课件,15,第二节 PCR扩增仪的分类与结构,各孔独立控温的定量PCR仪 不同样品槽分别拥有独立的智能升降温模块,各孔独立控温,适合多指标快速检测。 SmartCycler的软件允许一台仪器同时操作六个样品模块,既满足高速批量要求,又能灵活运用,还可实现任意梯度反应。 SmartCycler上样不如传统方法方便,而且需要独特的扁平反应管,使用成本较高。,精选课件,16,第二节 PCR扩增仪的分类与结构,SmartCycler荧光定量PCR仪,精选课件,17,第三节 PCR扩增仪的性能指标、操作规程及常见故障的排除,一、PCR扩增仪的性能指标,精选课件,18,(二)荧光检
9、测系统,激发光源,检测器,发光二极管,卤钨灯光源,超低温CCD,光电倍增管,精选课件,19,第三节 PCR扩增仪的性能指标、操作规程,(三)软件 简便的人性化设计最能满足其需求。 新型的PCR仪很注重程序编写的简易性,易学易用 具有实时信息显示、记忆存储多个程序、自动倒记时、自动断电保护等功能,很多还可以免费升级。,精选课件,20,(四)其他 多样化样品基座设计、热盖等都使PCR仪越来越人性化。,第三节 PCR扩增仪的性能指标、操作规程,精选课件,21,第三节 PCR扩增仪的性能指标、操作规程,二、PCR扩增仪的操作规程 普通PCR扩增仪的操作非常简便,接通电源,仪器自检,设置温度程序或调出储存的程序运行即可。 定量PCR扩增仪的操作和普通PCR仪基本相同。,精选课件,22,第四节 PCR扩增仪的应用,三、PCR扩增仪的应用 1.感染性疾病的分子诊断和研究 2.遗传性疾病的分子诊断和研究 3.恶性肿瘤的分子诊断和研究 4.PCR扩增仪在移植配型上的应用 5.PCR扩增仪在法医学上的应用 6.PCR扩增仪在分子生物学其他领域的应用,精选课件,23,谢 谢!,