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1、精选课件,1,PCR基因扩增仪 (PCR Gene Amplifier),精选课件,2,内容提要,1. PCR基因扩增仪的工作原理 PCR技术的原理及发展 PCR基因扩增仪的工作原理 2. PCR扩增仪的分类与结构 定性PCR扩增仪 实时荧光定量PCR扩增仪 3. PCR扩增仪的性能指标、操作规程 PCR扩增仪的性能指标 PCR扩增仪的操作规程 4. PCR扩增仪的应用,精选课件,3,第一节 PCR基因扩增仪的工作原理,一、PCR技术的发展 Khorana (1971)等最早提出核酸体外扩增的设想：“经DNA变性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可合成tRNA基因。
2、” 1985年，Kary Mullis在Cetus公司工作期间，发明了PCR。Mullis要合成DNA引物来进行测序工作，却常为没有足够多的模板DNA而烦恼。 1983年4月的一个星期五晚上，他开车去乡下别墅的路上,猛然闪现出“多聚酶链式反应”的想法。 1985年10月25日申请了PCR的专利，1987年7月28日批准（专利号4,683,202 ），Mullis是第一发明人； 1985年12月20日在Science杂志上发表了第一篇PCR的学术论文，Mullis是共同作者； 1986年5月，Mullis在冷泉港实验室做专题报告，全世界从此开始学习PCR的方法。,聚合酶链式反应（PCR）是一种用
3、于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点，是能将微量的DNA大幅增加。因此，无论是化石中的古生物、历史人物的残骸，还是几十年前凶杀案中凶手所遗留的毛发、皮肤或血液，只要能分离出一丁点的DNA，就能用PCR加以放大，进行比对。这也是“微量证据”的威力之所在。,精选课件,4,第一节 PCR基因扩增仪的工作原理,二、PCR技术的原理 体外核酸扩增，加热使双链DNA解开螺旋，在退火温度条件下引物同模板DNA杂交，在Taq DNA聚合酶，dNTPs(脱氧核糖核苷三磷酸)，Mg2+和合适pH缓冲液存在条件下延伸引物，重复 “变性退火引物延伸”过程至2
4、5-40个循环，呈指数级扩大待测样本中的核酸拷贝数。 简单的说，PCR仪就是利用DNA聚合酶对特定基因做体外或试管内的大量合成，基本上它是利用DNA聚合酶进行专一性的连锁复制。目前常用的技术，可以将一段基因复制为原来的一百亿至一千亿倍。,精选课件,5,第一节 PCR基因扩增仪的工作原理,模板DNA的变性：模板DNA经加热至93左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备,模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；,DNA模板与引物结合物在TaqD
5、NA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链,重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需24分钟，23小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍,精选课件,6,第一节 PCR基因扩增仪的工作原理,PCR基因扩增仪的工作关键 DNA聚合酶在高温时会失活，因此，每次循环都得加入新的DNA聚合酶，不仅操作烦琐，而且价格昂贵，制约了PCR技术的应用和发展。 从PCR反应基本原理可以看出，PCR基因扩增仪工作关键是温度控制。,精选课件,7,第一节 PC
6、R基因扩增仪的工作原理,精选课件,8,第二节 PCR扩增仪的分类与结构,精选课件,9,第二节 PCR扩增仪的分类与结构,荧光实时定量PCR（real-time quantitative PCR,RQ-PCR）技术 在PCR反应体系中加入特异性的荧光染料或探针 荧光信号的变化真实地反映了体系中模板的增加 通过检测荧光信号，从而实时监测整个PCR反应过程 最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析,精选课件,10,第二节 PCR扩增仪的分类与结构,精选课件,11,第二节 PCR扩增仪的分类与结构,金属板式实时定量PCR仪 可作为普通PCR仪使用 可带梯度功能 可容纳的样本量大，无需特殊耗材 温度均一性
7、欠佳，有边缘效应，标准曲线的反应条件难以做到与样品完全一致,精选课件,12,第二节 PCR扩增仪的分类与结构,ABI 7500荧光定量PCR仪,MJ公司Chromo 4荧光定量PCR仪,Bio-rad公司iCycler荧光定量PCR仪,精选课件,13,第二节 PCR扩增仪的分类与结构,离心式实时定量PCR仪 温度均一性较好 使用的是同一个激发光源和检测器，随时检测旋转到跟前的样品，有效减少系统误差 可容纳样品量少，有的需用特殊毛细管作样品管，增加了使用成本，也不带梯度功能,精选课件,14,第二节 PCR扩增仪的分类与结构,Rotor-Gene 3000荧光定量PCR仪,Light CycleT
8、M荧光定量PCR仪,精选课件,15,第二节 PCR扩增仪的分类与结构,各孔独立控温的定量PCR仪 不同样品槽分别拥有独立的智能升降温模块，各孔独立控温，适合多指标快速检测。 SmartCycler的软件允许一台仪器同时操作六个样品模块，既满足高速批量要求，又能灵活运用，还可实现任意梯度反应。 SmartCycler上样不如传统方法方便，而且需要独特的扁平反应管，使用成本较高。,精选课件,16,第二节 PCR扩增仪的分类与结构,SmartCycler荧光定量PCR仪,精选课件,17,第三节 PCR扩增仪的性能指标、操作规程及常见故障的排除,一、PCR扩增仪的性能指标,精选课件,18,（二）荧光检
9、测系统,激发光源,检测器,发光二极管,卤钨灯光源,超低温CCD,光电倍增管,精选课件,19,第三节 PCR扩增仪的性能指标、操作规程,（三）软件 简便的人性化设计最能满足其需求。 新型的PCR仪很注重程序编写的简易性，易学易用 具有实时信息显示、记忆存储多个程序、自动倒记时、自动断电保护等功能，很多还可以免费升级。,精选课件,20,（四）其他 多样化样品基座设计、热盖等都使PCR仪越来越人性化。,第三节 PCR扩增仪的性能指标、操作规程,精选课件,21,第三节 PCR扩增仪的性能指标、操作规程,二、PCR扩增仪的操作规程 普通PCR扩增仪的操作非常简便，接通电源，仪器自检，设置温度程序或调出储存的程序运行即可。 定量PCR扩增仪的操作和普通PCR仪基本相同。,精选课件,22,第四节 PCR扩增仪的应用,三、PCR扩增仪的应用 1.感染性疾病的分子诊断和研究 2.遗传性疾病的分子诊断和研究 3.恶性肿瘤的分子诊断和研究 4.PCR扩增仪在移植配型上的应用 5.PCR扩增仪在法医学上的应用 6.PCR扩增仪在分子生物学其他领域的应用,精选课件,23,谢 谢！,
