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1、 毛竹林及阔叶林土壤细菌及真菌对氧化亚氮排放的贡献 硝化和反硝化是土壤中氮素损失的潜在途径. 随着人类活动的加剧, 土壤中的硝化和反硝化作用会向大气中释放更多的温室气体氧化亚氮. 由人为活动所产生的氧化亚氮中, 耕地土壤的释放量贡献了65%左右1. 反硝化作用(denitrification)是指把硝酸盐等较复杂的含氮化合物转化为氮气 、 一氧化氮和二氧化氮的过程, 这是厌氧条件下(60%的土壤孔隙水含量)陆地氧化亚氮产生的主要生物过程. 在过去的 1 个多世纪里, 人们通常认为反硝化过程都是由进行无氧呼吸的细菌进行的, 但近年来的研究发现, 真菌也可以进行反硝化作用2. 在分离获得的真菌中,
2、 已经发现很多种具有产生氧化亚氮的能力.虽然在纯培养条件下, 真菌产生氧化亚氮活性与细菌相比要低几个数量级3, 但是对土壤氧化亚氮产生能力的测定结果表明, 真菌产氧化亚氮的能力远超细菌4-5. Laughlin 等4研究表明: 在草地及耕作泥炭土中使用放线菌酮抑制真菌活性时, 土壤氧化亚氮排放通量减少了 80%, 而用链霉素抑制土壤细菌活性后, 土壤氧化亚氮排放通量仅减少 30%左右. 真菌在土壤氧化亚氮排放中的重要贡献可能是由于其生物量在土壤微生物中占据着非常大的优势. 土壤原位氧化亚氮排放通量与土壤真菌生物量呈显着正相关,而与反硝化细菌及其他土壤性质没有明显的相关6. 已经有一些关于草地、
3、 湿地以及耕地等生态系统土壤真菌氧化亚氮排放的研究, 但是对于林地土壤的研究尚不多见4-5, 7-8. 部分经济林的集约经营程度越来越高, 它们对土壤微生物, 特别是对土壤真菌的干扰也非常剧烈. 由于真菌可以耐受更低的 pH 值,且在林地土壤中的生物量也往往高于细菌, 因此真菌在南方酸性森林土壤氧化亚氮排放过程中可能具有更大的贡献9-10. 毛竹 Phyllostachy edulis 是中国南方的主要竹种11, 地下根鞭发达, 穿透能力极强, 可以帮助毛竹不断向周边森林蔓延并替代原有森林. 此外, 毛竹林的经济价值较高, 目前农户对其的集约经营程度也在不断提高. 由于真菌对人为干扰较为敏感,
4、 原有天然林改变为毛竹林必将导致土壤真菌群落结构的变化, 进而导致土壤氧化亚氮排放通量的改变. 本研究利用选择性抑制方法, 研究毛竹林及阔叶林土壤细菌及真菌对氧化亚氮排放的贡献率, 揭示不同微生物在林地土壤温室气体排放中的作用及其影响机制, 从而对阔叶林演变成毛竹林进行生态风险评估, 为合理经营毛竹林, 减少温室气体排放提供理论依据.1 材料与方法1.1 样品采集在浙江省临安市天目山国家级自然保护区进行野外调查, 在相似地形地貌条件下分别选取 4 块毛竹林地(moso bamboo forest, MB)和 4 块阔叶林地(broad-leaved forest, BL). 所有样地土壤均为花
5、岗岩发育的红壤, 毛竹林地土壤为粉黏土(黏粒 43.27%, 粉粒 40.34%, 砂粒 16.39%), 阔叶林地土壤为粉黏壤土(黏粒 38.50%, 粉粒 48.68%, 砂粒 12.82%). 采用 5 点采样法采取土样, 采集表层(020 cm)土壤,装入自封袋带回实验室. 去除大的动植物残体及石砾后, 样品过 2 mm 钢筛混匀, 四分法后弃去多余样品. 样品分为 2 份, 1 份立即进行室内培养试验和磷脂脂肪酸分析, 另 1 份风干后测定土壤 pH 值、 有机质、 全氮质量分数等基本理化性质.1.2 试验设置混合后的新鲜土样用于室内培养试验, 测定细菌及真菌对土壤氧化亚氮排放通量的
6、贡献率. 试验共分为 4 个处理: 对照(control), 不添加任何抗生素; 链霉素(streptomycin, strep), 土壤中添加 1.0mgg-1的链霉素;放线菌酮(cycloheximide, cyclo), 土壤添加 2.0 mgg-1放线菌酮;链霉素+放线菌酮(both), 土壤中同时添加 1.0 mgg-1的链霉素和 2.0 mgg-1放线菌酮. 重复 3 次土样-1.1.3 试验方法1.3.1 土样培养试验 称取相当于 20.0 g 干质量的新鲜土壤放进 150 mL 棕色试剂瓶中, 加入 4.0 mL 不同抗生素溶液(对照仅加去离子水)使土壤抗生素质量分数达到试验设
7、计要求. 试剂瓶装好土样后, 先在4 条件下过夜预培养, 以使抗生素逐渐扩散至整个土壤空隙中. 之后, 将试剂瓶移至室温培养, 向土壤中分别加入 100 mmolL-1葡萄糖和 100 mmolL-1硝酸钾, 使土壤含水量达到田间最大持水量的 90%左右. 将试剂瓶用塞上橡胶塞后, 向其中充体积分数为 10%的乙炔以抑制氧化亚氮继续还原成氮气. 将土样与溶液充分混合后, 放在培养箱中 18 培养 7 h 后, 开始用针筒抽取试剂瓶内气体, 岛津(GC-2014)气相色谱测定氧化亚氮通量.1.3.2 磷脂脂肪酸分析 新鲜样品带回实验室后, 立即进行冷冻干燥, 测定土壤磷脂脂肪酸摩尔质量浓度. 磷
8、脂脂肪酸测定参照 Wu 等12方法. 称取 3.0 g 冻干土样, 采用氯仿提取总磷脂后, 将样品装载硅胶柱(SPE-Si), 分别用氯仿、 丙酮和甲醇洗脱中性脂、 糖脂和极性磷脂. 将所有组分进行甲基化, 氯仿回收, 氮气吹干后气相色谱(安捷伦 6890N)测定. 总磷脂脂肪酸摩尔质量浓度用于表征土壤总微生物量. 细菌的代表性组分为: i15:0, a15:0, 15:0, i16:0, 16:1w7c, i17:0, a17:0, cy17:0, 17:0, 18:1w7c, cy19:0w8c; 真菌特征性脂肪酸为 18:2w6,9c13. 磷脂脂肪酸摩尔质量浓度以 nmolg-1干土表
9、示.1.3.3 土壤理化性质分析 土壤有机质采用重铬酸钾外加热法测定; 全氮采用凯氏法测定; 硝态氮和铵态氮采用氯化钾浸提, 流动分析仪测定; 有效磷采用 Bray 法测定, 盐酸-氟化铵溶液浸提, 比色法测定; 速效钾采用乙酸铵提取-火焰光度法测定; pH 值采用 12.5 土水比, 酸度计测定14.1.4 数据分析采用 Excel 2007 和 SPSS 18.0 处理数据, Duncan 单因素方差分析法比较各处理之间的差异显着性(P 0.05), 配对样本 t 检验比较毛竹林与阔叶林土壤理化性质及土壤细菌与真菌反硝化能力的差异显着性, 采用 Pearson 相关系数检验不同微生物氧化亚
10、氮排放能力与土壤理化性质的相关关系.2 结果与分析2.1 土壤理化性质所有样地土壤均表现出不同程度的酸性, 而不同毛竹林及阔叶林样地之间土壤 pH 值差异也较大.分析结果表明: 毛竹林不同样地土壤有机质、 全氮、 有效磷及硝态氮质量分数均没有显着差异, 而阔叶林不同样地之间土壤有机质、 全氮及速效钾也没有显着差异, 说明不同林分土壤有机质及全氮质量分数分布总体较为均一. 对比 2 种林分, 阔叶林土壤 pH 值显着低于毛竹林(P0.05), 而有机质与有效磷质量分数显着高于毛竹林土壤(P0.05). 相反, 毛竹林土壤速效钾质量分数显着高于阔叶林(P0.05,表 1). 毛竹林入侵阔叶林或阔叶
11、林人工演替为毛竹林后, 由于地上植被以及凋落物输入的改变, 土壤理化性质也发生了相应的变化. 此外, 毛竹林人为干扰程度也在不断增加, 如劈灌、 翻耕、 施肥以及伐竹等, 都会导致养分含量的改变, 如土壤有机质质量分数. 肖复明等15研究表明: 长期集约经营后, 毛竹林土壤有机碳逐渐下降. 而毛竹林土壤速效钾高于阔叶林, 可能是由于人为施肥所造成的.2.3 细菌及真菌氧化亚氮排放贡献不同林分土壤以及同一种林分不同样地之间氧化亚氮的排放通量都存在较大差异, 其中毛竹林 MB-1 样地土壤氧化亚氮排放通量最高, 其次是 MB-4, BL-3 及 BL-4 等样地, MB-2 和 BL-1, BL-
12、2 等样地的氧化亚氮排放通量最低(图 1). 相关分析结果表明: 土壤氧化亚氮排放通量与本研究所选择测定的部分土壤理化性质没有显着相关性. 土壤氧化亚氮排放与许多因素有关, 如土壤含水量、 容重、 pH 值、 有机质质量分数、 氮肥施用量等等19. 因此, 本研究中不同林分甚至同一林分不同样地之间存在的巨大差异, 可能是由多种土壤环境因素共同决定的, 其影响因素还有待于进一步的研究. 统计结果表明: 毛竹林和阔叶林土壤氧化亚氮排放通量没有显着差异(t=-0.574, P=0.606). 在以往对森林土壤氧化亚氮排放通量的研究过程中, 往往将土壤温度和湿度作为关键因子20, 但近年来的研究则发现
13、: 氮素水平是一个关键因素21. 对比 2 种不同林分, 无论是土壤全氮还是矿质态氮均没有显着差异(表 1), 这可能是 2 种林分氧化亚氮排放通量没有差异的主要原因.无论是单独添加放线菌酮、 链霉素还是同时添加 2 种抗生素, 均显着抑制了土壤氧化亚氮排放通量(P0.05). 同时添加 2 种抗生素对土壤氧化亚氮排放通量的抑制率在 73%83%, 但是同一林分的不同样地之间没有显着差异, 而单独添加链霉素或者放线菌酮的处理对土壤氧化亚氮排放通量的抑制率变化较大. 图 2 结果表明: 在 2 种林分的样地中, 除了个别样地外(MB-2, BL-1), 其他所有土壤真菌氧化亚氮排放通量均显着高于
14、细菌(P0.05). 如在毛竹林土壤中, 真菌对土壤氧化亚氮排放的贡献率为40.8%56.2%, 远高于细菌(9.0%33.4%). 阔叶林土壤中也呈现同样的规律, 真菌对土壤氧化亚氮排放贡献率为 38.0%62.8%, 而细菌的贡献率为 12.6%32.4%(图 2). 目前, 已有研究表明, 在森林生态系统中的真菌群落对土壤氧化亚氮排放的贡献要大于草地以及人为耕作的生态系统4-5, 8. 同时, 真菌与细菌对土壤氧化亚氮排放的贡献比在不同的生态系统中存在着较大的差异22. 毛竹林与阔叶林由于其地上植被以及人为干扰程度不一样, 真菌与细菌对土壤氧化亚氮排放的贡献率也就存在着一定的差异.与此类
15、似的是, 在 2 种林分的不同样地之间, 土壤真菌及细菌对氧化亚氮排放通量的贡献率也有着显着的差异(P0.05). 如在毛竹林土壤中, 尽管氧化亚氮排放通量显着低于样地 MB-1(P0.05), 但是MB-3 样地的土壤真菌氧化亚氮排放贡献率达到 56.2%, 显着高于 MB-1 样地真菌排放贡献率(49.7%,P0.05). 而在阔叶林土壤中, BL-3 和 BL-4 样地土壤总氧化亚氮排放通量显着高于(P0.05)另外 2 个样地的同时, 其真菌氧化亚氮排放贡献率也显着高于样地 BL-1 和 BL-2(P0.05).将土壤氧化亚氮排放通量与所有土壤理化性质及微生物生物量进行 Pearson 相关分析. 结果表明:真菌与细菌的氧化亚氮排放贡献之间存在极显着的相关性(P0.01), 可能与 2 种微生物群落反硝化的环境条件要求较为相似有关. 值得注意的是, 真菌及细菌氧化亚氮排放通量与其生物量之间没有显着相关性, 说明生物量并非是决定氧化亚氮排放通量的关键因素. 由于只有一些特定的真菌即细菌种类可以进行反硝化作用, 如真菌中的镰刀菌属 Fusarium spp.具有较强的氧化亚氮释放能力23. 因此, 真菌的氧化亚氮排放贡献主要与真菌群落及特定种群的反硝化活性相关. 今后仍然需要从微生物物种
