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1、 探讨高海拔地区应用血液基因组DNA提取试剂盒的最佳条件 摘要：目的 探讨在高海拔地区应用血液基因组DNA提取试剂盒的最佳条件。方法应用RelaxGene Blood DNA System血液基因组DNA提取系统, 对109份血样 (每份血样分为2组, 实验组和对照组) 提取DNA, 实验组采用优化条件提取DNA、对照组采用试剂盒说明书方法提取DNA。结果 实验组109份样品中有13份DNA浓度在20-50ng/L之间, 35份在51-80ng/L之间, 61份样品80ng/L;DNA浓度比例高于对照组 (P0.05) 。实验组109份样品中DNA纯度OD260/OD280比值在1.7-1.9
2、之内的有105份, 比值小于1.7的有3份, 比值1.9的有1份, DNA纯度比例高于对照组 (P80 ng/L.The concentration of DNA was higher than the control group (P0.05) .The ratio of the DNA purity OD260/OD280 in the experimental group 109 samples was 105 in the sample, and the ratio was less than 1.7.The ratio was less than 1.7, and the ratio
3、 was greater than that of the control group (P0.05) .Conclusion Uses reagent box extraction blood genome team DNA in the high elevation area, needs to optimize the extraction condition, obtains the DNA density and the purity can satisfy the downstream experiment to request, also the duplication is g
4、ood.Keyword：plateau environment; DNA extraction; optimization;全血基因组DNA是科学研究、临床疾病分析及亲子鉴定等许多研究领域不可缺少的原材料。目前, 提取DNA的各类方法较多, 除各实验室有自身独特的方法外, 应用最为广泛的还属商品化的血液基因组提取试剂盒, 不仅使用方便成本低廉且液体量较少相对污染较低。西藏自治区地处我国西南边疆, 平均海拔在3000米以上, 由于地势高而形成了特有的高原低压低氧、寒冷干燥的环境。在高原环境中提取血液基因组可采用商品化的血液基因组提取试剂盒, 但是如果按照试剂盒中说明书方法进接提取血液基因组其产量
5、和纯度很难满足后续研究的需要。本课题组经过多次尝试研究, 摸索出了一套血液基因组试剂盒提取DNA的优化方法, 该方法在高原环境下提取的DNA能够获得满意的产量和纯度。1 材料与方法1.1 实验材料2017年5月西藏阜康医院体检的健康体检者的血液样品109份作为基因组DNA提取的材料。1.2 主要试剂与仪器RelaxGene Blood DNA System血液基因组DNA提取系统 (非离心柱型) 天根生化科技 (北京) 有限公司, 其产品组成:细胞裂解液CL2250ml, 缓冲液FG 120ml, 洗脱缓冲液TB60ml, 蛋白酶K1ml。其余试剂为分析纯, 水为双蒸灭菌水。高速台式离心机 (
6、Sigma) ;超微量紫外可见分光光度计 (Thermo) 。1.3 实验分组将109份血液样品的每一份分为2组:实验组 (109份) 和对照组 (109份) 。1.4 实验方法1.4.1 对照组按300l抗凝血750l裂解液提取DNA, 具体的操作方法对照组采用RelaxGene Blood DNA System血液基因组DNA提取系统试剂盒说明书提取方法。实验组按300l抗凝血900l裂解液提取DNA, 采用RelaxGene Blood DNA System血液基因组DNA提取系统 (非离心柱型) 试剂盒, 对实验条件和方法进行优化和改良, 其方法是:1) 将抗凝血样 (2ml血液/管)
7、 从-80冰箱中, 室温融化, 利用移液器在样品管中把血样充分混匀, 取300l血样置于尖底离心管中并向管中加入750l细胞裂解液CL, 颠倒混匀10次。重复2次。2) 离心12 000rpm 1min、弃上清, 将离心管倒置于干净吸水滤纸上5min, 此时确保管底沉淀在管中。3) 按1001配制FG与蛋白酶K混合液, 现用现配。将混合液按照200l/管的量加入到已弃上清并倒置5 min的EP管内, 立即涡旋混匀至无团块。4) 65水浴过夜 (20h) , 最初的2h内每10-15min颠倒混匀2-3次, 并用手指弹匀, 水浴后可见溶液的颜色从红色变为黄绿色。5) 加入异丙醇150l, 涡旋混
8、匀至丝状或簇状DNA为止。6) 离心12 000rpm 5min、弃上清将EP管倒置于干净的吸水滤纸上、确保沉淀在EP管中、加入150l 70%乙醇、涡旋振荡5s、离心12 000rpm 2 min弃清, 再次重复加入150l70%乙醇、离心弃上清后将EP管倒置于干净的吸水滤纸上, 15min。6) 加入100lTB缓冲液, 室温过夜 (24h) 。1.4.2 DNA浓度、纯度的检测采用紫外线分光光度法3。1.5 统计学方法应用SPSS19.0统计软件进行数据处理。计量资料以s表示, 组间比较采用t检验;各构成比的比较采用2检验。以P0.05为差异有统计学意义。2 结果2.1 DNA不同浓度比
9、例比较实验组109份样品中DNA浓度没有80ng/l;DNA浓度比例高于对照组见表1。表1 实验组与对照组DNA不同浓度比例比较 (ng/L)*P0.05与对照组比较2.2 DNA不同纯度比例比较实验组109份样品中DNA纯度OD260/OD280比值在1.7-1.9之内的有105份, 比值小于1.7的有3份, 比值1.9的有1份, DNA纯度比例高于对照组见表2。表2 实验组与对照组DNA不同纯度比例比较 (OD260/OD280)*P1.9, 表明有RNA污染;OD260/OD280比值80ng/l;DNA纯度OD260/OD280比值在1.7-1.9之内的有105份, 比值小于1.7的有3份, 比值1.9的有1份, DNA浓度和纯度比例均高于对照组。采用改良方法在高原地区提取的DNA无论是完整性还是浓度纯度均能保证后续实验研究的需要同时适合临床研究及检测应用。参考文献1王秀娟, 肖瑞, 张传领, 等.血液基因组DNA试剂盒提取条件的优化J.疾病监测与控制杂志, 2015, 12 (9) :855.2韩芬霞, 杨丽芬.全血DNA提取方法的改进及PCR检测J.江苏农业科学, 2012, 40 (8) :56.3余凯琳, 邓正栋, 严济.血液基因组DNA提取方法改良J.南昌大学学报 (医学版) , 2014, 54 (10)
