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1、1,北京大学药物毒理学3药物毒理学-急性毒性和局部毒性,药物研发全过程,2,北京大学药物毒理学3药物毒理学-急性毒性和局部毒性,化学药品注册申报所需药理、毒理学资料,16.药理毒理研究资料综述。 17.主要药效学试验资料及文献资料 18.一般药理学的试验资料及文献资料。 19. 急性毒性试验资料及文献资料。 20. 长期毒性试验资料及文献资料。 21.过敏性、溶血性和局部（血管、皮肤、 粘膜、肌肉等）刺激性等特殊安全性试验资料和文献资料,22.复方制剂中多种成份药效、毒性、药代动力学相互影响的试验资料及文献资料。 23.致突变试验资料及文献资料。 24.生殖毒性试验资料及文献资料 25.致癌试
2、验资料及文献资料。 26.依赖性试验资料及文献资料。 27.非临床药代动力学试验资料及文献资料,3,北京大学药物毒理学3药物毒理学-急性毒性和局部毒性,急性毒性通常为毒理学研究的最初步的资料包括经口、吸入、经皮和其它途径的急性毒性,第一节急性毒性和急性毒性试验Acute Toxicity and Acute Toxicity Test,4,北京大学药物毒理学3药物毒理学-急性毒性和局部毒性,急性毒性(Acute Toxicity)/单次给药毒性（Single dose Toxicity）: 实验动物一次 或24小时内多次接受某一药物所 引起的毒性效应，甚至死亡,一、概念,5,北京大学药物毒理学
3、3药物毒理学-急性毒性和局部毒性,实验动物接受药物的方式或途径不同“一次”的含义也有所不同 经口和注射途径，“一次”是指在瞬间给与试验动物染毒。 经呼吸道吸入与经皮肤给药，“一次” 是指在一个规定的期间内实验动物持续地接触受试化学物的过程,6,北京大学药物毒理学3药物毒理学-急性毒性和局部毒性,多次”的含义是指当药物毒性很低时，即使一次给予实验动物最大染毒容量还观察不到毒性作用，便需要在24小时内多次染毒，以达到规定的限制剂量,7,北京大学药物毒理学3药物毒理学-急性毒性和局部毒性,急性毒性试验 (Acute toxicity test,急性毒性试验可以分为两类： 以死亡为终点：以检测受试物急
4、性毒性上限指标, 主要是求得半数致死剂量或浓度LD50/LC50 或近似 LD50。 非致死性急性毒性为终点：检测非致死性指标,可 得到急性毒性 LOAEL和 NOAEL,8,北京大学药物毒理学3药物毒理学-急性毒性和局部毒性,LD50：引起实验动物死亡一半时的剂量。 LOAEL( Lowest Observed Adverse Effect Level) 观察到有害作用的最低水平水平，在规定的暴露条件 下，通过试验和观察，受试物引起机体形态、功能、生长、发育或者寿命某种有害改变的最低剂量或者浓度。 NOANEL ( No Observed Adverse Effect Level) ： 未观
5、察到有害作用水平，在规定的暴露条件下，通过试验和观察，受试物未引起机体形态、功能、生长、发育或者寿命某种有害改变的最低剂量或者浓度,9,北京大学药物毒理学3药物毒理学-急性毒性和局部毒性,三、经典急性致死性毒性试验要点,10,北京大学药物毒理学3药物毒理学-急性毒性和局部毒性,一）实验动物的选择和处置,11,北京大学药物毒理学3药物毒理学-急性毒性和局部毒性,总的原则是应尽可能模拟人可能的给药途径。灌胃给药应注意禁食，灌胃后继续禁食 24小时,动物检疫,染毒途径,通常情况下观察57天,动物分组,根据实验设计随机分组, 至少设 3个剂量组, 一般设57个剂量 组，每组810只动物,12,北京大学
6、药物毒理学3药物毒理学-急性毒性和局部毒性,了解受试药物的理化特性 根据受试药物的试验规范要求，决定试验设计和 LD50 计算方法。 剂量的设计: 参考化学结构和性质类似药物的毒性资料。 总的原则：用少量动物，以较大的剂量间隔进行预实 验，获得1090%的致死剂量范围，然后在这个剂量范 围内以合适的间距设几个（至 少3个）剂量组,二）实验设计,组距的对数值 i=（LgLD100-LgLD0）/(n-1,13,北京大学药物毒理学3药物毒理学-急性毒性和局部毒性,14,北京大学药物毒理学3药物毒理学-急性毒性和局部毒性,15,北京大学药物毒理学3药物毒理学-急性毒性和局部毒性,详细观察和记录实验动
7、物的中毒体征、 发生时间、体征发展的过程、 死亡前特征等。有助于了解该受试物的靶器官并可能为中毒机制提供线索。 实验动物的体重变化：给药前、后和死亡时测体重. 非致死性指标的可逆性,三）观察,给药后一般要求观察14天,16,北京大学药物毒理学3药物毒理学-急性毒性和局部毒性,啮齿类急性毒性试验中常见的体征和观察给药后，动物往往出现兴奋抑制死亡，或者抑制死亡的现象,17,北京大学药物毒理学3药物毒理学-急性毒性和局部毒性,四）病理学检查,死亡动物应及时进行大体解剖及病理检查。试验结束时，将存活动物处死，亦应进行大体解剖。大体解剖发现病变的组织器官应作病理检查,18,北京大学药物毒理学3药物毒理学
8、-急性毒性和局部毒性,五）LD50（LC50）的计算原理,急性毒性的剂量-反应关系曲线模式图,求出回归方程:Y=a+bX。 X为剂量对数值，Y为死亡率 的概率单位。利用此式即可 求出受试化学物的LD50及其 95%可信区间,19,北京大学药物毒理学3药物毒理学-急性毒性和局部毒性,受试物A、B、C剂量反 应关系曲线的斜率相 同，而LD50 ABC，因 此，急性毒性大小的次 序为：CBA。 化学物D的LD50与C相同。 但斜率比C大，可见在 低于LD50的剂量时急性 毒性CD,4种不同受试物的LD50及剂量/反应 (死亡) 关系曲线,利用LD50比较不同受试物的急性毒性,20,北京大学药物毒理学
9、3药物毒理学-急性毒性和局部毒性,LD50是经统计学计算而得到的毒性参数，并报告其95%可信限，较少受实验动物个体易感性差异的影响，因而是最重要的急性毒性参数,21,北京大学药物毒理学3药物毒理学-急性毒性和局部毒性,六）LD50（经典急性毒性试验）的意义,标准化药物毒作用强度，评价药物对机体的毒性，比较不同药物毒性的大小。 计算药物的治疗指数 为其它毒理学试验剂量的选择提供参考。 通过比较不同途径的LD50值，获得生物利用度的信息。 试验结果可用来推测人类的致死剂量以及中毒后的体 征，为临床毒副反应监测提供参考,22,北京大学药物毒理学3药物毒理学-急性毒性和局部毒性,LD50值给予的有效信
10、息少，作用有限。LD50值不能等同于急性毒性，死亡仅仅是评价急性毒性的许多观察终点之一,六）急性毒性试验存在的局限性,23,北京大学药物毒理学3药物毒理学-急性毒性和局部毒性,LD50的波动性很大, LD50没有稳定的数值。EU的80个实验室测定5种化学物的LD50，差别可达2.448.38倍,24,北京大学药物毒理学3药物毒理学-急性毒性和局部毒性,急性毒性试验所用的剂量与临床人用剂量差别很大。不能期望使用急性毒性试验的结果来拟定人的临床剂量。 物种差异对LD50 的影响大。人和动物对药物的敏感性差别很大，如人和小鼠的致死剂量相差很大。16种化学药品的人致死剂量小于小鼠LD50值的110 。
11、 消耗的动物数量大。经典法一次需30-70只动物,25,北京大学药物毒理学3药物毒理学-急性毒性和局部毒性,ICH（人用 药物注册技术要求国际协调会）LD50的结论,在北美、欧洲和日本，“经典”的LD50测定已不再是单剂量毒性试验的正式要求。 申报资料要求建议进行逐渐增加剂量的耐受性研究，以监测不同剂量下的毒性反应。 建议采用两种哺乳动物。可以用两种啮齿类动物或一种啮齿类动物加一种非啮齿类动物的严格设计的、单次给药的、逐渐增加剂量的耐受性研究，取代啮齿类动物或非啮齿类动物LD50测定的要求。 如果相关的话，ICH建议应用药理学上相关的主要代谢产物应进行单次给药的毒性研究。 ICH规定在新药的报
12、批材料中，不必准确的测定LD50，只需了解其近似致死量和详细观察记录中毒表现即可,26,北京大学药物毒理学3药物毒理学-急性毒性和局部毒性,第二节急性毒性替代试验Alternative Methods for Acute Toxicity,27,北京大学药物毒理学3药物毒理学-急性毒性和局部毒性,固定剂量法（fixed dose procedure） 上、下移动法（up/down method） 限量试验（limit test,28,北京大学药物毒理学3药物毒理学-急性毒性和局部毒性,固定剂量法（fixed dose procedure）OECD， 1992，2001。不以动物死亡作为观察终点
13、,29,北京大学药物毒理学3药物毒理学-急性毒性和局部毒性,上、下移动法（up/down method） OECD， 1998，2001。以死亡为终点,动物：大鼠， 69只 剂量：根据最初的资料确定第1只动物的染毒剂 量，由第1 只动物染毒后的反应决定第2个 动物的染毒剂量，每次间隔24h 的顺序给 每只动物染毒一次， 观察：14天,30,北京大学药物毒理学3药物毒理学-急性毒性和局部毒性,上-下法（up/down method,31,北京大学药物毒理学3药物毒理学-急性毒性和局部毒性,限量试验（Limit test,动物：大鼠或小鼠10 20只，雌雄各半。 剂量：单次染毒剂量5g/kg体重（
14、食品毒理学，15g/kg体重） 结论： 无死亡， 最小致死剂量MLD该限量 死亡动物数 50%，LD50 限量 死亡动物数50%，重新设计，进行常规的急性毒性试验,32,北京大学药物毒理学3药物毒理学-急性毒性和局部毒性,局部毒性为受试物对机体接触部位的毒效应，不包括经接触部位的吸收而引起的系统毒性。局部毒作用的研究可以是受试物剂量与局部毒作用的剂量-反应研究，但对于产品的安全性评价，经常是固定剂量以研究时间-效应关系。 局部毒性又称耐受性试验,第三节 局部毒性试验 Local Toxicity Test,33,北京大学药物毒理学3药物毒理学-急性毒性和局部毒性,皮肤原发性刺激试验（skin
15、primary irritation test）包括单次和多次皮肤刺激试验，完整皮肤和破损皮肤刺激试验等。观察终点为皮肤刺激和皮肤腐蚀。 皮肤刺激（dermal irritation）是指其皮肤接触化学物后产生的局部可逆性的炎症变化。 皮肤腐蚀（dermal corrosion）是指其皮肤接触化学物后产生的局部不可逆性组织损伤,一、皮肤原发性刺激试验,34,北京大学药物毒理学3药物毒理学-急性毒性和局部毒性,方法： 脱毛： 试验前24小时，机械或化学法脱毛，不可损伤表皮，去毛范围各约3cm3cm。 染毒： 取受试物0.5ml (或0.5g) 直接涂在皮肤上，然后用纱布及玻璃纸覆盖，再用无刺激性
16、胶布和绷带加以固定，敷用时间为小时 试验结束后，用温水或无刺激性溶剂除去残留受试物，在一只家兔或豚鼠背部脊柱两侧可各准备3个去毛区，可进行剂量-反应研究，或测试多种受试物。 观察： 涂抹部位于染毒后1、24、48小时 观察皮肤反应。皮肤反应：红斑，水肿。 按其严重程度评分,Draize试验,动物：健康、皮肤无损伤的白色家兔、豚鼠。至少4只,35,北京大学药物毒理学3药物毒理学-急性毒性和局部毒性,反应 分值 反应 分值 红斑 水肿 无红斑 0 无水肿 0 略见红斑 1 稍有水肿 1 中度红斑 2 明显可见(边缘高出皮肤) 2 严重红斑 3 皮肤隆起水肿轮廓清晰 3 紫色红斑并有焦痂形成 4 水中隆起1mm 4 总分 8,皮肤刺激反应评分,36,北京大学药物毒理学3药物毒理学-急性毒性和局部毒性,二、眼原发性刺激试验,眼原发性刺激试验（eye primary irritation test）包括单次和多次眼刺激试验等。观察终点:眼刺激和眼腐蚀。 眼刺激性（eye irritation）：眼睛前表面接触受试物后产生的眼睛可逆性炎性变化。 眼腐蚀性（eye corrosion）：眼睛前表面接
