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1、化妆品体外哺乳动物细胞微核试验In Vitro Mammamlian Cells Micronucleus Test1 范围本方法规定了体外哺乳动物细胞微核试验的范围、试验目的、定义、试验基本原则、试验材料与试剂、试验步骤、结果判定标准。本方法适用于化妆品原料或产品的致突变性的检测。2 试验目的本试验用于检测体外培养的哺乳动物细胞染色体损伤和非整倍体变异，以评价受试物致突变的可能性。3 定义3.1 微核 micronuclei染色单体或染色体的无着丝粒断片，或因纺锤体受损而丢失的整个染色体，在细胞分裂后期，无法迁移至两极而遗留在细胞质中。末期之后，单独形成一个或几个规则的次核，被包含在子细胞的
2、胞质内，因比主核小，故称为微核。3.2 着丝粒 centromere染色体中将两条姐妹染色单体结合起来的DNA区域。3.3 非整倍体aneuploidy二倍体染色体组中缺少或额外增加一条或若干条完整的染色体的变异类型。3.4 非整倍体诱变剂 aneugen作用于细胞有丝分裂或者减数分裂周期，导致细胞分裂异常，诱发非整倍体的物质。3.5 染色体断裂 chromosome breakage染色体臂出现长度大于染色体臂宽度的裂隙。3.6 染色体断裂剂 clastogen引起染色体发生断裂的物质。3.7 细胞毒性 cytotoxicity对细胞结构或功能的有害效应，最终可导致细胞死亡。3.8 致突变性
3、 mutagenicity导致基因或染色体结构中产生可遗传的DNA碱基对序列变化的能力。4 试验基本原则体外哺乳动物细胞微核试验是一种用于检测哺乳动物细胞经受试物处理后是否产生微核的致突变性检测方法。本方法适用于检测有丝分裂细胞暴露于受试物期间或之后致染色体断裂和/或诱发非整倍体的能力。如果短期（3 h6 h）处理的试验结果为阴性或不明确时，需要进行无代谢活化系统的长期处理试验（用受试物处理细胞1.52.0个正常细胞周期）。试验分为使用和不使用肌动蛋白聚合抑制剂细胞松弛素B（CytochalasinB，cytoB）两种方法。方法一：在细胞经过受试物处理，有丝分裂前使用cytoB，然后观察分析已
4、完成一次有丝分裂的细胞（双核细胞）微核率。方法二：不使用cytoB，细胞经过受试物处理后观察分析细胞微核率。当选用人类淋巴细胞时，建议采用方法一，因为不同来源的细胞周期不同，而且不是所有的细胞都对植物血球凝集素（PHA）有反应。如果有证据表明受试物干扰cytoB的活性，或cytoB可能影响细胞的生长（如小鼠淋巴瘤细胞株），建议采用方法二。5 试验材料与试剂5.1 细胞株：可选用中国仓鼠肺细胞株（V79或CHL）、中国仓鼠卵巢细胞株（CHO）、小鼠淋巴瘤细胞株（L5178Y）、人类淋巴母细胞株（TK6）或原代培养细胞。细胞在使用前应进行染色体数目稳定性和有无支原体污染的检查。5.2 培养基：根据
5、细胞类型来选择适宜的培养基。对于V79 、CHL或CHO细胞，常用MEM（Eagle）培养液加入10%胎牛血清和适量抗菌素(可用青霉素100IU/mL、链霉素100g /mL)。对于L5178Y或TK6细胞，常用RPMI 1640培养液加入10%马血清和适量抗菌素(可用青霉素100IU/mL、链霉素100g /mL)。5.3 溶液的配制5.3.1 活化系统：通常使用的是S9混合物（S9mix）。S9是从经酶诱导剂（Aroclor 1254或苯巴比妥钠和-萘黄酮联合使用）处理的啮齿动物肝脏获得的。S9的制备同细菌回复突变试验。S9的使用浓度为1%10%（终浓度）。S9 mix中所加辅助因子的量由
6、各实验室自行决定，但需确保S9 mix的活性，必须能明显活化阳性对照物。也可使用下述方法配制：S90.125 mLMgCl2（0.4 mol/L）0.02 mLKCl（1.65 mol/L）0.02 mL葡萄糖-6-磷酸1.791 mg辅酶（氧化型，NADP）3.0615 mg用无血清MEM培养液补足至1mL。5.3.2 cytoB溶液：用二甲基亚砜（DMSO）配制适当浓度的储备液，避光冷冻保存。cytoB的终浓度通常为3g/mL6g/mL，实验室应根据各种细胞系选择cytoB的适当终浓度，以达到理想的双核细胞出现频率。5.3.3 0.075 mol/L氯化钾溶液: 5.59g氯化钾加蒸馏水至
7、1000mL。5.3.4 固定液: 甲醇冰醋酸为31（V/V），临用前配制。5.3.5 姬姆萨（Giemsa）染液：取姬姆萨染料3.8g，置乳钵中，加少量甲醇研磨。逐渐加甲醇至375mL，待完全溶解后，再加125mL甘油，放入37温箱中保温48h。保温期间振摇数次，使充分溶解。取出过滤，室温保存，2周后使用，作为姬姆萨染液原液。使用时，取1份姬姆萨染液原液，与9份1/15 mol/L磷酸盐缓冲液（pH 6.8）混合，配成其应用液，现配现用。磷酸盐缓冲液（1/15mol/L，pH 6.8）配制方法如下：a）第一液：取磷酸氢二钠（Na2HPO4）9.47g溶于去离子水1000mL中，配成1/15m
8、ol/L溶液；b）第二液：取磷酸二氢钾（KH2PO4）9.07g溶于去离子水1000mL 中，配成1/15mol/L溶液；c）取第一液50mL加于第二液50mL中混匀，即为pH6.8的1/15 mol/L磷酸盐缓冲液。5.4 溶剂的选择：溶剂必须是非致突变物，不与受试物发生化学反应，不影响细胞存活和S9活性。首选溶剂是培养液（不含血清）或磷酸盐缓冲液（PBS）。当受试物不溶于培养液或PBS时，可选用DMSO作为溶剂，但终浓度不应大于0.5%。5.5 受试物的浓度选择及配制5.5.1 受试物浓度设置5.5.1.1 剂量设置：至少应设置3个可供分析的剂量。受试物没有细胞毒性时，从最高剂量往下设至少
9、2个剂量，一般情况下间隔系数可为23；当受试物有细胞毒性时，其剂量范围应涵盖从50%60%的细胞毒性到几乎无细胞毒性。5.5.1.2 最高剂量的选择：决定最高剂量的因素是细胞毒性、受试物的溶解度以及pH值、渗透压。受试物有细胞毒性时，最高剂量应能引起50%60%的细胞毒性；如果没有细胞毒性或沉淀，最高剂量应是5L/mL、5mg/mL 或0.01mol/L。对溶解度较低的物质，当浓度达到最大溶解度时仍无毒性，则最高剂量应是在最终培养液中溶解度限值以上的一个浓度。在某些情况下，应使用一个以上可见沉淀的浓度，溶解性可用肉眼鉴别，但沉淀不能影响观察。5.5.1.3 细胞毒性的确定：在S9存在和不存在两
10、种条件下依据细胞完整性和生长情况的指标来确定细胞毒性。方法一：使用cytoB，细胞毒性的确定可依据复制指数（Replication Index，RI）或胞质分裂阻断增殖指数（Cytokinesis Block Proliferation Index，CBPI）。式中：500为细胞总数；T=受试物组，C=阴性对照组细胞毒性 = 100 - RI式中：CBPI=1等同于100%细胞生长抑制；500为细胞总数。式中： T=受试物组，C=阴性对照组方法二：不使用cytoB，细胞毒性的确定可依据相对细胞增长数（Relative Increase in Cell Counts，RICC）或相对增殖倍数（R
11、elative Population Doubling，RPD）。细胞毒性 = 100 RICC式中：细胞毒性 = 100 - RPD5.5.2 受试物的配制：固体受试物应溶解或悬浮于适合的溶剂中，并稀释至适当浓度。液体受试物可直接使用或稀释至适当浓度。气体或易挥发的受试物应采用适当方法如用封闭式容器或细胞室。受试物应无菌，现用现配，否则须确认储存不影响其稳定性。5.6 对照的选择5.6.1 阳性对照物：阳性对照物包括染色体断裂剂和非整倍体剂。加S9时，断裂剂可以选用环磷酰胺（CAS号：50-18-0）和苯并芘（CAS号：50-32-8）；不加S9时，断裂剂可以选用阿糖胞苷（CAS号：147-
12、94-4）、丝裂霉素C（CAS号：50-07-7）、甲磺酸甲酯（CAS号：66-27-3）和4-硝基喹啉（CAS号：56-57-5）；非整倍体剂只用于不加S9时，可以选用秋水仙素（CAS号：64-86-8）和长春碱（CAS号：143-67-9）。如果短期处理试验方案在S9存在和不存在两种条件下都选用断裂剂作为阳性对照，那么长期处理试验方案应该选用非整倍体剂作为阳性对照。如果选用的细胞本身具有代谢能力，则不需要另外添加S9，阳性对照应该同时使用断裂剂和非整倍体剂。5.6.2 阴性对照物：应设阴性对照（溶剂），即仅含和受试物组相同的溶剂，不含受试物，其他处理和受试物组完全相同。此外，如未能证实所选
13、溶剂不具有致突变性，溶剂对照与本实验室空白对照背景资料有明显差异，还应设空白对照。6 试验步骤6.1 细胞准备：将一定数量的细胞接种于培养皿（瓶）中，以收获细胞时培养皿（瓶）的细胞未长满为标准，贴壁细胞一般以长到85%左右为佳。6.2 受试物处理6.2.1 方法一：使用cytoB吸去培养液，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗细胞，加入无血清培养液及一定浓度的受试物（需代谢活化者同时加入S9mix），置于培养箱中3 h6 h；结束后吸去含受试物的培养液，用PBS洗细胞2次以上，加入含10%血清的新鲜培养液和cytoB，继续培养至1.52.0个正常细胞周期（从加入受试物开始计算）后收集细胞。对于淋巴细胞，
14、最有效的方法是在有丝分裂原（如PHA）刺激后44 h48 h开始受试物处理，这时细胞开始进入分裂周期。如果短期（3 h6 h）处理的试验结果为阴性或不明确时，需要进行无S9的长期处理试验，用cytoB和受试物处理细胞1.52.0个正常细胞周期，在处理结束后收集细胞。如果已知或怀疑受试物（如核苷类物质）可能影响细胞周期（特别是P53活性细胞），则细胞收获时间应该再延长1.52.0个正常细胞周期。6.2.2 方法二：不使用cytoB与6.2.1处理方法相同，只是不加cytoB。6.3 收获细胞与制片：每次培养都应单独收获细胞和制片。6.3.1 消化：贴壁细胞用0.25%胰蛋白酶溶液消化，待细胞脱落
15、后，加入含10%胎牛或小牛血清的培养液终止胰蛋白酶的作用，混匀，放入离心管以 800r/min1000r/min 的速度离心5min，弃去上清液。悬浮细胞不需要消化，直接离心。6.3.2 低渗：加入0.075 mol/L氯化钾溶液2mL，用滴管将细胞轻轻地吹打混匀，37低渗处理1min5min；如果细胞混合液的分散度良好则不需要进行低渗处理。6.3.3 固定：加入2mL固定液，混匀后固定5min以上，以800r/min1000r/min的速度离心5min，弃去上清液。相同步骤，重复一次。6.3.4 滴片：加入数滴固定液，混匀。用混悬液滴片，自然干燥。6.3.5 染色：推荐用姬姆萨染色（5%10%姬姆萨染液，15min20min），也可用DNA特异性荧光染料（如：吖啶橙或Hoechst 33258）。如果需要区分染色体断裂剂和非整倍体诱变剂，可用荧光原位杂交（FISH）或引物原位标记等方法。6.4 阅片6.4.1 微核的判断标准微核一般为圆形或椭圆形；直径不超过主核的1/3；与主核在一个焦点平面上，与主核的颜色、结构特征及折光性一致；与主核之间没有核物质相连，可以和主核有边界的重叠，但能看清各自的核膜。6.4.2 方法一：使用cyto
