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1、项目名称：重要亲源分子对胚层诱导和分化的调控首席科学家：孟安明 清华大学起止年限：2011.1至2015.8依托部门：教育部二、预期目标1.总体目标人类和脊椎动物的生命周期起始于受精卵胚胎的早期发育，对该过程的深入了解对于优生优育、人类健康和医学、畜禽生产、物种保护等都有重要的潜在价值。本项目将稳定一支高学术水平的研究团队，充分利用斑马鱼、爪蛙和哺乳动物细胞系等研究系统的优势和互补性，重点研究母源和父源因子，研究它们在胚胎卵裂、体轴决定、胚层形成、细胞分化与迁移等过程中的作用，深入了解它们发挥功能的分子机制和调控网络，从而更全面、系统地认识脊椎动物早期胚胎发育的分子调控网络；在相关领域取得一些
2、理论、方法和技术突破，促进我国基础医学和生殖、代谢、干细胞相关疾病等领域的发展；培养高水平研究人才，形成能够持续进行创新性研究的能力；促进我国发育生物学学科的发展。2.五年预期目标在五年的实施过程中，本团队将围绕设定的关键科学问题，从分析胚层的决定和分化、卵母细胞及早期卵裂的周期控制以及干细胞分化潜能的控制等生物学现象入手，实现如下目标： 1）鉴定一批脊椎动物母源因子，明确数个因子在早期胚胎胚层诱导和分化中的作用，认知中囊胚转换的分子调控机理；发现相关的新的信号通路或新的信号网络调控机制，加深对早期胚胎发育调控机理的认识。2）鉴定一批脊椎动物父源特异性RNA，有可能突破性地发现父源RNA在胚胎
3、早期发育中的普遍作用和特异性作用及其机理。3）了解已知的几个多能性因子在胚层形成和分化中与母源胚层决定信号之间的调控关系，探索数个母源或父源因子在干细胞多能性和定向分化中的作用。4）建立新的母源和父源因子鉴定和功能研究技术，完善相应当研究平台。5）发表高影响因子文章510篇；在国际主流期刊上发表论文5080篇。6）培养可持续发展的学术梯队：博士后、副研究员10-12名；博士生40-50名；技术支持人员8-10名三、研究方案总体研究方案1学术思想本项目的中心学术思想是以斑马鱼和爪蛙为模式生物，辅以哺乳动物胚胎干细胞研究系统，从分子、细胞和胚胎整体水平阐述胚胎早期发育过程中，预存于卵子和精子中的亲
4、源分子在胚层发育中的功能和调控机制，着力于未知亲源分子的鉴定、发育功能分析、基因表达调控机制分析和对细胞信号通路的新的调控机制的探索。2技术路线本项目将利用斑马鱼和爪蛙两种模式动物的优势，采用反向遗传分析和正向遗传分析的策略，鉴定与胚层形成相关的母源和父源因子，然后利用已有的基因表达、功能和机制研究技术手段，探讨这些因子在早期发育中的功能和作用机制。在利用正向遗传学方法研究斑马鱼母源因子对胚层诱导和分化的影响方面，我们利用Tol2转座子插入法捕获母体基因，当转座子基因组（含GFP报告基因）插入到一个母体基因内时，GFP报告基因的表达将受该母体基因启动子的控制，因而在卵母细胞中可观察到GFP的存
5、在；通过TailPCR、inverted PCR、RACE等方法，可以比较容易地克隆出该母体基因。如果杂合体之间配种得到的F2纯合体能够长大到性成熟，雌性个体因该母源基因被转座子破坏而不能表达出有功能的蛋白，其产出的卵子中就缺乏该母源基因产物，与野生型或杂合型雄性个体的精子受精后的胚胎就可能出现胚层诱导和分化等方面的缺陷，称之为母源突变体。我们获得母源突变体之后，将检测突变体胚胎中各个胚层的标记基因的表达、Wnt、Nodal、BMP等关键发育信号通路的组份的表达；在突变体中过表达一些胚层诱导和分化的关键基因如sqt、beta-catenin、bmp2b、fgf8、sox32等,确定它们与突变的
6、母源基因之间的遗传互作关系。为了深入阐明有重要功能的母源因子的作用机理，将利用酵母双杂交、免疫共沉淀等技术途径鉴定其互作因子，再在哺乳动物细胞系中研究其在相关信号通路中的作用，获得的结果再回到胚胎中进行验证。另一方面，对于那些在斑马鱼上发现的有重要功能的母源基因，将在爪蛙胚胎上检验其功能的保守性。在反向遗传分析方面，我们将结合转录组分析和卵母细胞基因下调技术鉴定参与爪蛙胚层形成的母源基因，利用转录组分析技术（比如deep sequencing）鉴定斑马鱼父源特异性RNA。然后设计特异性的吗啉环修饰的反义寡核苷酸去抑制相应基因的mRNA（或小RNA）的表达。在爪蛙上，将反义寡核苷酸注射到收集的卵
7、母细胞中，可以有效地剔除储存在卵母细胞中的目标mRNA，体外培养2天后(可以使原来已存在的蛋白降解)，再将卵母细胞回移到处理过的雌蛙输卵管中，并进行自然受精（本项目组成员陶庆华教授实验室是全世界屈指可数熟练掌握该方法的团队）。在斑马鱼上，我们正在建立类似的技术。抑制父源特异性RNA相对比较简单（因为进入卵子的特定父源RNA的量极少），将反义寡核苷酸注射到单细胞受精卵中即可。对于注射了反义寡核苷酸的胚胎，将首先从形态学上观察胚胎的胚层变化，然后检测常用的胚层标记基因的表达，确认其可能的作用。在鉴定到对胚层形成有重要影响的父源或母源基因后，我们将根据其表达谱、表达产物的性质和突变体表型，利用体内、
8、体外系统研究其发挥生物学功能的分子机理。考虑到Wnt和TGF-beta信号，以及细胞全能性相关因子在胚胎早期发育中起着广泛而重要的作用，因此鉴定出对胚层形成有重要影响的亲源基因后，将重点研究它们与细胞信号网络和细胞分化调控因子的相互作用关系。另一方面，TGF-beta和Wnt信号，以及与干细胞全能性相关的重要调控因子大多数都在早期胚胎发育、特别是胚层形成中发挥重要作用，因此我们也计划分析TGF-beta和Wnt信号相关调控因子以及干细胞全能性相关因子（如Oct4， nanog， Klf4等）在胚层形成中的功能和作用机制。在前期工作中，我们已经通过酵母双杂交、染色体免疫沉淀、基因芯片等技术发现了
9、许多受Wnt和TGF-beta信号通路调节的基因，以及与这两个信号通路上的介导因子或调节因子相互结合的蛋白，在本项目中将重点研究它们在胚胎早期发育，特别是胚层形成中的功能和对相关信号通路的调控机理。在研究它们的生物学功能方面，将主要开展以下分析：1）利用原位杂交确定它们在胚胎发育中的时空表达谱；2）将体外合成的野生型mRNA或突变型mRNA注射到胚胎中，观察其对胚胎图式发育的影响，并检测相关标记基因表达的变化；3）合成Morpholino反义寡核苷酸，将其注射到胚胎或爪蛙的卵母细胞中，使相应基因功能被减弱或失活，观察胚胎发育异常（检测形态和标记基因）；4）将一个基因的mRNA或反义寡核苷酸与相
10、关信号通路的其它基因的mRNA或反义寡核苷酸组合注射，探讨基因互作关系，建立相关发育途径的分子调控网络。在研究新基因对信号通路的调节机理方面，将主要利用体外的细胞培养系统，分析内容主要包括：1）该基因过表达或被抑制时对Wnt和TGF-beta信号的影响；2）过表达或被抑制时对Wnt和TGF-beta信号通路中的介导因子或调节因子的表达、修饰或稳定性的影响；3）亚细胞定位及其动态变化；4）功能域的鉴定；5）获得的机理在体内系统中的验证，希望获得相应的遗传学证据。在研究策略上，我们将充分发挥这两种模式生物的特色和技术优势，特别注意两种模式动物研究系统之间的结合、胚胎体内研究与培养细胞体外研究之间的
11、结合、以及不同信号通路之间的交互作用研究，从而保证研究成果的高质量、高水平，在分子机理上认识胚层诱导和分化、母源-合子转换等发育过程的调控规律。3创新点和特色本项目关注的生物学问题是胚胎发育中胚层的诱导和分化，这是所有动物发育过程中的重要阶段，是多细胞生物形成的最原始和最基础性的事件。现有的研究结果显示，胚层的发育是精卵配子中预存的亲源因子和受精卵合子基因之间互作的结果，其中亲源因子起到了决定性的起始和调控作用。但关于亲源因子在胚层形成和分化中的功能研究，受技术限制，一直是早期胚胎发育研究中的难点。本项目选用脊椎动物胚层形成研究中最常用的斑马鱼和爪蛙为模式生物，辅以体外研究系统，利用分子、细胞
12、、生化、组学等多种研究手段，希望能揭示亲源因子在脊椎动物早期胚胎发育，特别是胚层诱导和分化中的功能和分子机制。因此本项目完全能够产生创新性的研究成果。本项目的特色之一是分别从鉴定参与胚层发育的新基因和从胚层形成相关细胞信号和细胞全能性因子入手，以鉴定新基因和新功能为切入点，在很大程度上保证了研究的原创性和新颖性，使整个研究从一开始就站在了本领域的最前沿。本项目的特色之二是选择了合适的研究系统，即斑马鱼、爪蛙和体外细胞系统。斑马鱼和爪蛙均具有产卵量大、体外受精、胚胎体外发育的特性，容易观察胚胎早期的发育过程，也为未受精卵（卵母细胞）和受精卵中的基因修饰（如mRNA的过量表达或抑制）提供了基本条件
13、，因而已成为研究脊椎动物早期胚胎发育的两个最常用的模式系统。此外，斑马鱼上容易进行转基因、诱变等遗传操作以及细胞谱系标记和跟踪；爪蛙胚体大，较容易进行显微手术操作；爪蛙的卵母细胞可以较长时间体外培养，使剔除母源蛋白和抑制母源RNA表达成为可能。体外哺乳动物细胞系在研究细胞信号转导机理方面具有不可替代的优势，可用于阐明基因/蛋白发挥作用的分子机理和网络。本项目将这三个研究系统结合起来，可以充分利用其各自的优势，实现优势互补；又可以在不同系统中互相印证，为实验结果和结论的可靠性提供保证。本项目的特色之三是，在人员组成上，既各有专攻，有互为补充。本项目是在原重大研究计划项目“胚胎早期发育的分子机理研
14、究”基础上的延续，在该项目的资助下，孟安明，陈晔光，张建和吴畏实验室已经建立起紧密的合作关系和通畅的共享技术平台。得益于近两年回国的陶庆华教授和曹萤教授的加盟，给这个团队引入了爪蛙母源基因功能分析技术和干细胞全能性因子在爪蛙中的功能研究体系，加上原有的多年从事早期胚胎发育研究的高水平发育生物学家和长期从事细胞信号转导研究的高水平细胞生物学家，使得这个团队可以全方位地开展胚层形成研究。这几个方面的研究人员的协作将有助于从分子机理上揭示胚层形成的规律，更有可能取得重大的发现。此外，本项目的所有人员都全时在国内工作，主要骨干都有独立的实验室，这样一个稳定的高水平的研究团队，为实现项目的预期目标提供了
15、充分的保障。4取得重大突破的可行性分析研究早期胚胎发育中母源因子对胚层诱导和分化的调控机理是国际上发育生物学的研究热点，但也是难点；而父源RNA在胚胎早期发育中的作用是最近才认识（推测）到的，但尚缺乏实验证据，因而是可产生突破性发现的研究方向。近几年来，本项目的主要参加人员在胚胎发育的调控机理方面做了大量、扎实的工作，获得了一批有重要科学价值的成果。在此基础上，我们计划把研究进一步集中在“亲源因子对胚层形成的调控”这个方向上，取得重大突破性成果的可能性是很高的。工作基础方面，孟安明，陈晔光，张建、吴畏、赵庆顺实验室完全立足国内，已经发现多个参与脊椎动物早期胚胎发育调控的新基因，并详细阐述了它们
16、调控胚胎发育的分子机制和它们与Wnt、TGF-beta等信号的关系，在世界主流杂志Cell、Science、Dev Cell、Development、EMBO J、Blood，Genome Res，PNAS，J Neurosci，J Cell Sci、J Biol Chem、Dev Biol等发表多篇研究论文，并有许多合作发表的高水平论文。陶庆华和曹萤也已经在国内建立了独立的实验室，全时在国内工作，已完成了很有希望的基础性工作（见工作基础），并与参与本项目的其它实验室开始了合作研究。本项目将这几个研究组结合起来，集中精力，从不同角度共同研究早期胚胎发育中胚层形成的调控机理，可以实现不同研究系统的互补和研究结果的相互验证，促进各实验室研究深度的提高，大大提高了取得重大突破的可能性。这样实质性的合作研究是单个研究体系、单个实验室所难以企及的。5. 课题设置（一）课题设置的思路为了
