09级生物技术专业食用菌实验指导

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1、 实验一 母种培养基配制培养基是人工配制提供微生物生长的基质，食用菌是真菌，人工培养食用菌， 都要配制适合它们生长的培养基。栽培食用菌首先需要培养菌种，在食用菌栽培中，一般菌种分三级：母种、原种和栽培种。 母种培养基常用于菌种分离、提纯、扩大及菌种保藏，广泛采用半合成培养基。半合成培养基：就是化学成分部分确定，一部分不确定的培养基。 一 实验目的和要求了解母种培养基的配方，熟悉母种培养基（PDA或PSA）的配制方法。二 培养基配方：（PDA）去皮马玲薯200g 葡萄糖20g 琼脂20g 水1000ml pH自然（6.8-7.0）本培养基适合大多数食用菌菌丝生长。三 实验器材、材料和用具天平 电

2、炉 1000ml搪瓷量筒 18x180试管9ml培养皿 烧杯 长镊子 剪刀 玻璃棒 止水夹 纱布 棉花 橡皮圈250ml三角瓶 牛皮纸 记号笔 标签纸 葡萄糖 琼脂 马玲薯四 实验步骤与方法1. 选好的马玲薯洗净去皮，发芽的要挖去芽眼，用小刀切成小块或薄片，称取200g放入1000ml搪瓷量筒，加水少于1000ml水,加热煮沸到薯片酥而不烂时为止（约10-20分钟），用二层或四层纱布过滤，取其滤液补足为1000ml,加入20g琼脂，小火加热，用玻璃棒不断搅拌以防止培养基溢出和焦底，待琼脂完全熔化时加入20g葡萄糖，搅拌溶解，最后补足培养基至1000ml.我们每小组都不是配1000ml培养基，而

3、是500ml同学们应该怎样操作？ 2. 分装 琼脂在摄氏40度凝固，应在培养基凝固前分装，用分装装置分装。（1）以右手食指及母指控制止水夹，左手拿试管，将分装装置玻璃管插入试管内，当培养基流入管内时，注意控制流量，使管内培养基的高度约为试管的五分之一，分装过程中，勿使培养基沾到试管口，为什么？（2）试管口塞上棉塞，将试管7支或10支一捆，在每捆的棉塞上包一层牛皮纸，用橡皮圈或绳子扎好，竖放，待灭菌。（3）将多余的培养基分装在250ml三角烧瓶内，每瓶100ml，塞上棉塞包一层牛皮纸，待灭菌。（4）将9cm培养皿一包，待灭菌。 五 思考题（1） 在日常生活中，食用菌一般称为菇或耳，你认识哪几种或

4、吃过哪几种菇或耳？（2） 在试管口塞上棉塞有什么作用？（3） 分装过程中，勿使培养基沾到试管口，沾上了会有什么影响，如何处理？实验二 高压蒸汽灭菌、常压灭菌 灭菌是食用菌制种和熟料栽培一项关键技术，它关系到制种和栽培的成败。高压蒸汽灭菌和常压灭菌都是采用湿热灭菌的原理，湿热蒸汽比干热灭菌好：（1）热蒸汽比热空气穿透力强;(2) 湿热蒸汽对细胞成分的破坏作用更强；（3）蒸汽存在潜热，当气体变为液体时可放出大量热量，故可迅速提高灭菌物品的温度。一 实验目的和要求通过实验学习掌握手提式高压灭菌锅使用方法。二 实验物品及用具手提式高压灭菌锅 上一实验需灭菌的物品 三操作步骤：（1）先在外锅加入适量的水

5、，然后将上一实验需要灭菌的物品放入内锅，管口或瓶口向上不要紧贴锅边，避免蒸汽冷凝水进入试管内或瓶内。 （2）盖上锅盖，盖时应将盖上的放气管插入内锅壁管孔内，然后按对称方式扭紧锅盖上的螺丝，并将盖上的放气阀打开（直立）。 （3）将灭菌锅放在电炉上加热，当锅内水煮开后即有气体从放气孔排出，待有大量热蒸汽排出时（也就是连续热蒸汽排出）再继续排气5-10分钟，然后关闭放气阀开始灭菌。 （4）当压力表指针到1kg/cm处时，开始计时，并让压力表指针始终保持此压力20-30分钟，然后去火，自然降温，待指针回到零时打开放气阀，然后将锅盖打开（对称方式松开螺丝。 （5）摆斜面 灭菌后待管内培养基温度冷却至摄氏

6、50-60度时，将试管取出斜放在木条上，使试管内的培养基成一斜面，斜面的长度为试管长度的二分之一。注：常压灭菌这次实验无法做，因为时间太长，一般需要8小时以上，如有机会以后再和同学们说。四. 思考题 1为什么第一和第二个实验要一起做，如果第二个实验不和第一个实验一起做，设想一下第一个实验的培养基会出现什么情况？2为什么说灭菌是食用菌制种和熟料栽培一项关键技术，如果灭菌不彻底以后会出现什么情况？实验三 食用菌母种分离技术 食用菌的孢子就相当于植物的种子，在自然界中，食用菌就靠孢子来繁殖后代的。但是在人工栽培时，人们至今都不用孢子直接播种，因为孢子很微小，很难在生产中直接应用，而是用孢子或子实体组

7、织、菌丝组织体萌发而成的纯菌丝体作为播种材料。人们通常所指的菌种，实际上就是指人工培养的纯菌丝体。母种是指从大自然首次分离得到的纯菌丝体。并且是菌种生产的第一程序，因此又被称为一级种。纯菌丝体在试管斜面上再次扩大繁殖后，则形成再生母种，所以在生产上用的母种实际上都是再生母种，它即可以繁殖原种，又适合菌种保藏。一 实验目的和要求掌握食用菌母种的制作技术，学会母种的分离方法。二 实验器材和原料恒温培养箱 电炉 手术刀 接种针 接种铲 接种箱 酒精灯 长镊子 记号笔 标签纸 平菇种菇 香菇种菇 75%酒精棉球 PDA培养基 灭菌的培养皿三 操作步骤1. 种菇的选择：从产量高、长势好、适应性强、无杂菌

8、、无病虫害的群体中选择菇形正、朵大、菌盖厚实、生长健壮、八成熟的子实体作为分离材料。菇种应保持菇体洁净备用。2. 组织分离：此法生产中最常用的方法，它操作简单、菌丝萌发快、分离所得的菌种遗传性稳定，在培养条件适合的情况下，能保持原有菇种的优良性状和特性。（1） 将上一实验准备的PDA三角瓶培养基用水浴熔化；（2） 将上一实验准备的灭菌培养皿，每人二套，不要打开，在培养皿底皿上用记号笔等分成四（划十）；（3） 用75%酒精棉球擦菇体表面消毒；（4） 用75%酒精棉球擦净双手，在接种箱内将菇体撕开，撕开的一面不能接触箱体，菇体侧放；（由于我们人多，条件所限，只能在实验室做，只要操作得好成功率也是很

9、高的。）；（5） 用消毒手术刀，待手术刀冷后，在菌盖与菌柄交接处的组织切取一小块（约2x3mm）,在酒精灯旁，将培养皿盖打开一小缝，便于操作即可，放入培养皿内适当位置，动作要快，减少污染机会。重复一次，也就是放二小组织块，即用标签纸做好记号贴在培养皿底皿上。 3.孢子分类：此法是将子实体成熟后产出的孢子收集在培养基上，萌发并长成菌丝而 获得的纯菌丝体。（1） 将接种环在酒精灯上消毒，要将接种环的金属丝烧红，冷却后（2） 对准菇体的菌褶，插入菌褶轻轻抹两下，然后在培养皿另两处各点一下即可，做好记号。 香菇、平菇各做一培养皿，做好后放在摄氏25度恒温箱内倒置培养7天左右，组织分离的即可进行转管扩大

10、繁殖成母种，孢子分离的时间稍长些。四 思考题；（1）食用菌母种分离成功的关键是什么？（3） 培养皿为什么要倒置培养？实验四 母种形态观察及扩大培养同学们已经进行了母种的分离，这次我们来观察母种的生长情况，区分香菇、平菇菌丝体，观察它们的形态。要用于生产，我们分离的菌丝体是远远不够的，那就要进行扩大培养。一实验目的和要求初步了解食用菌菌丝体的形态，区分香菇和平菇菌丝体形态特征，掌握母种扩大培养的方法。二 实验器材和材料恒温培养箱 接种铲 接种靶 接种箱 酒精灯 记号笔 标签纸 直尺 75%酒精棉球 香菇、平菇菌丝体培养皿 三 操作步骤1. 母种形态观察（1） 从恒温培养箱内取出培养皿，记录分离实

11、验成功与失败；（2） 不要打开培养皿。用直尺分别测量香菇、平菇生长直径，来衡量菌丝体生长速度；（3） 观察香菇、平菇菌丝体的形态特征；（参考描述 香菇； 菌丝洁白、细短、生长整齐、呈棉绒状、不产生色素、生长速度中等。平菇； 菌丝洁白、浓密、粗壮、生长整齐、爬壁力强、不产生色素。）2. 母种扩大培养培养皿接试管（1） 双手洗净用5%酒精棉球擦手消毒，点燃酒精灯，右手拿接种铲，将接种铲顶端烧红，并将要伸进培养皿和试管的部分在火焰上来回过几次灭菌；（2） 在酒精灯旁，左手拿起分离培养皿，大拇指和中指夹住培养皿盖，小拇指和无名指托住培养皿底皿，在要打开培养皿的皿盖处，在酒精灯过火几次，但不能对着烧；（

12、3） 在酒精灯旁，用大拇指和中指打开培养皿盖，打开大小以方便操作为宜，不能完全打开，待接种铲完全冷后伸入培养皿内，将直径最外边的菌丝体切成3x3mm或3x5mm大小的菌丝块；（4） 将接种铲插在试管架上，盖上培养皿，拿一支斜面试管，拔松试管棉塞，按前方法拿好培养皿，将斜面试管放在培养皿上，用食指固定，用右手小拇指将试管棉塞取下夹住，试管口稍突出培养皿边缘，用火焰封住试管口，拿起接种铲在火焰上稍过一下火，伸入培养皿，冷却后，铲取一小块带培养基的菌丝块，迅速放入试管斜面中间菌丝面朝上，放下接种铲，将棉花塞塞好试管，贴上标签，标签上注明品种，接种时间和接种人。 试管接试管 这种方法是用于保藏菌种和外购菌种的扩大培养。（1） 与上法同；（2） 左手平托两支试管，大拇指按住试管，一支是供接种用的菌种试管，另一支是待转接母种的斜面试管，两支试管的斜面朝上；（3） 将两支试管的管口部分靠近火焰，用右手的小手指夹取一试管棉塞，再用无名指和小手指夹取另一棉塞，并立即以火焰灼烧管口，并适当转动，操作过程应在酒精灯火焰3cm远处进行；（4） 用冷却的接种耙，将已长满菌丝的培养基分成0.5cm宽的菌丝块，再用接种铲铲一块0.3x0.5cm放入待接试管的斜面中间，菌丝面朝上。放下接种铲，将棉花塞塞好试管，贴上标签，标签上注明品种，接种时间和接种人。一般一支母种可扩接20-30支试管。